田兄玲, 刘丛学, 张黎敏, 姜 涛, 张德清, 王 俭

(新疆医科大学第一附属医院1影像中心， 2医院动物研究中心, 乌鲁木齐 830054)

包虫病是一种人、畜共患的传染性疾病，广泛流行于全球畜牧业为主的地区。泡型包虫病(alveolar echinococcosis,AE)的发生率仅占包虫病总发生率的3%左右；人类患脑泡状棘球蚴病的发生率极低，仅占1%～2%。虽然患者数量较少，但危害程度远远比细粒棘球蚴病严重。因脑泡状棘球蚴病的自然发生率较低，临床研究工作开展困难。本研究采用3种不同的接种方法建立脑泡状棘球蚴病新西兰大白兔模型，旨在建立操作简便、稳定可靠、重复性强的理想动物模型，为脑泡状棘球蚴脑病的基础、临床等各项研究提供一个支持平台。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组健康清洁级新西兰大白兔45只，雌性，兔龄1.5～2个月，体质量1.8～2.0 kg，由新疆医科大学实验动物中心提供[许可证号：SYXK(新)2003-0001]。实验操作过程符合中华人民共和国科学技术部《关于善待实验动物的指导性意见》要求。本实验经新疆医科大学第一附属医院伦理委员会论证、批准实施(审批号：A-20090611002)。新西兰大白兔适应性饲养2 w后，随机分为两组：A组25只，B组20只。A、B组动物均经颅骨穿刺直接于脑组织内接种泡状棘球蚴病原头节。

1.2主要仪器及试剂GE Signa 3.0T超导磁共振扫描仪，表面线圈。超净工作台Olympus-CKX31倒置显微镜及光学显微镜，FA1004电子天平，恒温水浴箱，ZH-蓝星C立体定位仪。4.305 g/15 mL钆双胺(欧乃影)注射用造影剂，泡状棘球蚴病免疫4项试剂盒。

1.3MRI检查技术及参数全部动物均行平扫、钆对比剂增强及扩散加权成像检查。采集轴位、矢状位、冠状位。T1WI Flair、T2WI FSE及T2 Flair图像；层厚3 mm，层距0.3 mm，FOV 12 cm，采集次数2～3次。T1 Flair增强，钆双胺注射液0.2 mL/kg体质量，耳缘静脉高速度注射。扩散加权成像采用轴位，SE-EPI序列：重复时间(TR)6000 ms，回波时间(TE)60 ms，采集次数1次，b值为0 s/mm2和1 000 s/mm2，扩散梯度场施加在相位编码、层面选择及频率编码方向上。

1.4实验方法

1.4.1 接种液制备及活性鉴定

1.4.1.1 接种液制备 泡状棘球蚴保种鼠(甘肃属灰仓鼠，体质量约为80 g，3只)由新疆医科大学第一附属医院动物实验中心提供，制备过程在专业兽医指导和严格质量控制下完成。颈椎脱臼法处死泡状棘球蚴保种鼠，自保种鼠腹膜、腹腔及胸腔内取出新鲜泡状棘球蚴病灶，肉眼去除病变附着、坏死、钙化等组织；组织剪碎，轻度碾磨，生理盐水混匀漂洗，3层无菌沙布过滤4～6次；过滤液经5～8 min沉淀，7号注射器针头抽取沉淀的原头节及囊壁生发膜。将沉淀物加入适量生理盐水与青霉素(40 IU/mL)混液，制备成(3～5)×103个/mL及(5～10)×103个/mL泡状棘球蚴原头节混悬液，保存于0～4℃保温盒，以备接种。

1.4.1.2 接种液活性鉴定 不同浓度的原头节混悬液0.5 mL，经0.5%伊红染色5 min，囊液低速离心取沉淀，PBS洗涤，取约100 μL均匀涂于载玻片上，有活性虫体拒染，而死亡的虫体着色，镜下确定具有活性的虫体数(虫体数>80%)，见图1。

1.4.2 动物模型制备 取5%氯胺酮2 mL、安定2 mL、阿托品 1mL，用生理盐水稀释至20 mL，按5 mL/kg体质量经耳缘静脉推注，麻醉实验动物。动物取俯卧位，脑立体定位仪固定头部，脱除颅顶毛发；75%碘伏消毒，正中开口，剥离脂肪层、肌层及筋膜，暴露颅骨；于前囟正后方2.5 cm、矢状缝偏右0.5 cm处，用克氏针垂直钻开直径约1 mm的小孔，A组与B组分别用1 mL注射器斜前外侧进针约1 cm和0.3～0.5 cm，然后均注入(5～10)×103个/mL泡状棘球蚴原头节的混悬液约0.2 mL；注射针颅腔置留1 min左右，拔针，纱布按压约3 min；缝合，留观30 min，送回饲养房。兔舍室温恒定在18～23℃，自由饮水。每日观察手术切口，碘伏消毒；皮下注射先锋Ⅴ(0.1 g/d)，补液2 mL/d，3～5 d。记录动物进食水、精神状况、排尿便颜色和清亮度等。

图1 泡状棘球蚴原头节光镜图(×50)

1.4.3 MRI检查 分别于接种后30、60、90 d，应用美国GE Signa 3.0T超导磁共振扫描仪对所有动物进行扫描。动物麻醉，俯卧于特制检查平板上，表面线圈包绕头部。头先进，定位于颅骨正中、眼球正中后方约1 cm处。MRI常规及增强检查。

1.4.4 标本病理检查 过量麻醉处死实验动物，分离病变脑组织；肉眼观察病变，10%福尔马林液固定12 h后蜡封、切片，显微镜下观察。

2 结果

2.1建模成功率及MRI、病理检出率实验A、B组建模成功，病理检出率为100%，分别有5只(26.32%)及1只(5.56%)动物成功接种脑泡状棘球蚴病。建模成功的实验动物磁共振检查脑泡状棘球蚴病情况：90 d磁共振检出率为100%，60 d磁共振检出率为66.67%，30 d磁共振检出率为33.33%。

2.2病理结果

2.2.1 肉眼观察结果 6只成功模型均为单发病灶；A组5只病灶均位于脑皮质，靠近颅底脑膜及基底动脉环；B组1只病灶位于髓质内，靠近侧脑室壁；病灶0.31～1.23 cm；灰白色，团块，不能完全与脑组织分离；切开病灶内为无结构果冻样物质，质软，有弹性；A组2只病灶内有点状暗红色结节，1只病灶内有颗粒状黄色物质；所有病灶内部均无坏死液化样物质，无血管样结构。

2.2.2 HE染色及显微镜观察结果 HE染色后为泡状棘球蚴病，仅见角皮层而不见生发层，囊内无头节，周围可见炎细胞反应，大量中性粒细胞和淋巴细胞浸润，伴钙化见图2。

图2 接种90 d后脑泡状棘球蚴病病理图(×400)

2.3磁共振检查结果病灶多呈结节样稍长T1稍长T2信号，T2 Flair呈稍高信号，病灶无明确边界，周围见轻中度环状水肿影。钆喷酸葡胺对比增强病灶呈不规则环状强化。

3 讨论

目前，临床诊断泡状棘球蚴脑病主要依据影像学检查及实验室检查，但当常规影像学检查出现异常时，病程已进入晚期阶段，常见多脏器受累的表现。泡状棘球蚴脑病病变多位于大脑皮层或皮层下区，广泛者可累及侧脑室并可压迫、侵蚀颅骨，出现颅骨隆凸。该病的危害与其生长方式紧密相关，病变进展过程中，泡型棘球蚴以内殖性和外殖性芽生方式增殖，像恶性肿瘤一样呈浸润性生长[1]，因此又称为“寄生虫肿瘤”或“虫癌”。因此早期诊断泡状棘球蚴脑病并及早干预有可能成为提高患者预后的突破点。

因脑泡状棘球蚴病自然发生率较低，临床研究工作开展困难。既往模型多为大鼠模型，苗玉清等[2]采用泡球蚴混悬液人工感染小鼠腹腔，成功建立了感染泡球蚴病的动物模型，接种成功率>95%，为小鼠泡球蚴保种及动物模型的建立提供了丰富的经验，且操作简便，接种成功率高。有研究报道，选用小鼠与沙鼠，同时经额骨在颅腔内直接注入囊悬液及腹腔经门脉感染实验动物的方式，结果显示经额骨的方法建模5个月，小鼠颅腔内可见含有头节的片层状泡球蚴囊，而经门脉感染的小鼠仅在颅腔、脑室内可见极少量泡球蚴囊，但脑实质内未见泡球蚴囊[3]。

本实验选用体型中等、性情温顺的新西兰大白兔为实验动物，运用经颅骨直接穿刺注射泡球蚴混悬液的方法，经过血清免疫学及病理学检查证实成功建立脑泡状棘球蚴病新西兰大白兔模型6只。较既往大鼠模型研究具有如下的优势：(1)兔脑模型结构、大小均比大鼠更理想，易于接种及影像操作；(2)应用临床常规MRI的头颅线圈，就能够获得满意的MRI图像，不需要额外购买昂贵的动物线圈，节约了研究成本，有利于研究方法的推广和应用；(3)经颅骨直接穿刺注射泡球蚴混悬液方法简单易行，实验动物创伤小、恢复快，可有效降低实验动物的死亡率，有利于后期研究。

温浩等[4]研究发现，经颅骨接种泡状棘球蚴原头节颅内感染小鼠具有可行性，且接种成功率高。本研究所采用的方法实验周期短，操作简便，对实验动物创伤小。A组方法接种点较深，位于颅脑底部，贴近脑膜及颅动脉环的位置；B组接种点位于较浅的脑实质内。结果表明，A组接种成功率(26.32%)明显高于B组(5.56%)。分析可能原因：A组接种点靠近脑表面，是血管丰富的区域，原头节更易着床获取生长需要的营养物质，易于增生繁殖；B组接种点位于脑实质内，灶周血供不如脑表面丰富；接种后局部脑组织出现急性炎症反应，促发炎症级联反应，进而使血脑屏障(BBB)通透性增加而导致血管源性脑水肿。血脑屏障的结构和功能持续性受损，形成恶性循环，可能也会间接或直接影响到接种的成功率。经颅骨穿刺直接接种法可直接快速地感染实验动物脑组织，脑组织柔软阻力小，且血供丰富，病灶生长快速。兔脑容积较小，本实验中部分感染动物因脑组织损伤(出血、梗死等)、脑内占位、脑积水、颅内感染等因素，后期出现明显神经症状，甚至死亡。

本实验经由颅骨穿刺直视下的接种途径，使用浓度相同的泡状棘球蚴原头节混悬液，但采用不同穿刺深度进行脑泡状棘球蚴病模型建立，结果证明了方法的可行性，但接种率并不高。原因可能是：(1)实验动物颅腔小，磁共振特殊序列图像受影响大；(2)机体免疫反应是接种率低的主要原因，应考虑如何降低机体免疫，或人为建立寄生虫的免疫逃避；(3)病理检测的标本采集不全面，应扩大采集范围，如颅腔、脑室壁、脑脊液、病灶周围组织等均应列入检测标本范围以内。

综上所述，通过颅骨穿刺直视下脑内接种方法制作脑泡状棘球蚴病新西兰大白兔模型更易成功，接种点应靠近血管丰富的区域；脑泡状棘球蚴兔脑模型为进一步深入研究脑泡状棘球蚴病磁共振成像的早期诊断提供了技术平台。

参考文献：

[1] Bammer R．Basic principles of diffusion-weighted imaging[J]．Eur J Radiol，2003，45(1)：169-184.

[2] 苗玉清, 王瑞玲. 建立人工感染泡球蚴小鼠模型的体会[J]. 中国局解手术学杂志, 2000, 9(1):51-52.

[3] Will C，袁晓园. 脑包虫模型:鼠脑多房棘球蚴的实验性感染[J]. 国外医学：寄生虫病分册,1999,26(2):88-89.

[4] 温浩, 徐明谦. 实用包虫病学[M]. 北京：科学技术出版社，2010：28-35.