王 璐，段冉冉，赵 盼，周晓华，2

(1 华南农业大学 理学院，广东 广州510642;2 华南农业大学 生物材料研究所，广东 广州510642)

设计配合物分子的形状、对称性以及官能团结构，使其与DNA 分子匹配，从而对DNA 进行特异性识别，这一系列的研究工作是寻找新型DNA 结构探针、DNA 断裂剂、化学核酸酶和杀菌剂的研究基础，已引起科学界的广泛重视［1-3］.研究表明，DNA 特异性结合剂Lexitropsin 分子中都含有咪唑、吡咯和噻唑氨羰基基团［4］.2-取代苯并咪唑是苯并咪唑的重要衍生物，其化学和生物活性往往高于其他位置取代的衍生物.其中，2-氨甲基苯并咪唑(AMB)在结构上非常类似咪唑、嘌呤碱和嘧啶碱等生物配体，能与生物酶和受体等形成氢键、发生疏水作用和π-π相互作用，且具有良好的抗寄生物、抗癌和抗菌等活性［5-8］.目前含AMB 配体的配合物虽已有一些报道［7-11］，但大多只研究了晶体结构、热稳定性和光学性质，AMB 与DNA 的特异性识别研究报道很少［8-9］.因此研究AMB-过渡金属(Ⅱ)配合物不仅有助于了解其结构与生物活性的关系，而且为设计DNA 的特异性识别剂和断裂剂奠定理论依据.本文以AMB作主配体，以邻菲咯啉(phen)为辅配体，合成了2 个配合物:［Cu(AMB)2Cl］Cl·4H2O(配合物1)和［Cu(AMB)(phen)Cl］Cl·2H2O(配合物2).通过元素分析、IR、UV 和摩尔电导率等方法对配合物进行了组成和结构表征.用二倍稀释法测试了2 个配合物的最小抑菌浓度(MIC)，用紫外光谱(UV-Vis)、荧光光谱、相对黏度及琼脂糖凝胶电泳法初步研究了配合物与小牛胸腺DNA(ct-DNA)的相互作用.

1 材料与方法

1．1 仪器与试剂

上海宇隆仪器有限公司DDS-12A 型电导率仪;美国Nicolet 360 FT-IR 型红外光谱仪(KBr 压片);德国Elementar Vario EL Cube 元素分析仪;日本岛津UV-2550 型紫外/可见分光光度计;日本岛津RF-5301PC 荧光光谱仪;上海晶菱玻璃有限公司乌氏黏度剂;大连捷迈科贸有限公司凝胶电泳池;意大利米兰BIO-RAD Laboratories-Segrate 公司BIO-RAD 凝胶成像系统.

AMB·2HCl 参照文献［12］合成.ct-DNA、Tris、溴化乙啶(EB)、琼脂糖凝胶和pBR322 DNA 为生化试剂，其他试剂为分析纯.

1．2 配合物的合成

配合物1:称取1 mmol AMB·2HCl 溶于10 mL蒸馏水中，并用NaOH 调pH7～8，加入0.5 mol·L-1CuCl2溶液1.0 mL，反应10 min，并调pH 4.8，50 ℃条件下加热搅拌15 min，冷却至室温，过滤，室温静置1 d 后析出蓝色固体1，过滤并依次用少量水和乙醇洗涤后干燥.

配合物2:合成方法与配合物1 相似.按照n(Cu)∶n(AMB)∶n(phen)=1∶1∶1 投料，在合成配合物1 的反应液中加入5 mL phen 乙醇溶液.反应液在室温放置1周后析出蓝色晶体2，过滤，洗涤，干燥.

1．3 配合物的抑菌活性

通过二倍溶液稀释法测定了配合物1 和配合物2 的最小抑菌浓度(MIC).受试菌种为2 种革兰阴性菌(大肠埃希菌Escherichia coil 和沙门杆菌Salmonella typhi)和2 种革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus 和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis).

1．4 配合物与ct-DNA 的相互作用

配合物与ct-DNA 相互作用研究均在pH 7.2 的Tris-HCl/NaCl 缓冲液中进行.缓冲液含5 mmol·L-1Tris 和50 mmol·L-1NaCl.琼脂糖凝胶电泳试验中，每升TBE 电泳缓冲液(pH 8.3)含0.045 mol Tris、0.45 mol H3BO3和1 mol EDTA.ct-DNA 的浓度参照文献［13］确定.

1.4.1 紫外光谱 将0.062 5 mmol·L-1配合物溶液3 mL 和Tris-HCl / NaCl 缓冲溶液3 mL 分别加入样品比色皿和空白比色皿中，再分别加入等体积的ct-DNA 溶液，每次充分摇匀静置15 min 后，在200～400 nm 扫描配合物的紫外光谱.

1.4.2 荧光光谱 当含5.5 μmol·L-1ct-DNA 和4.8 μmol·L-1EB 混合溶液的荧光强度达到稳定后，逐步增加配合物的浓度，在λex=525 nm 和υscan=240 nm·s-1下，在550～650 nm 测定混合溶液的荧光强度.

1.4.3 黏度 在c(ct-DNA)=0.2 mmol·L-1下，依次增大配合物浓度，在(29.0 ±0.1)℃下，测定DNA-配合物缓冲溶液流过毛细管所需时间(t)，计算比黏度(η):

其中，t0为缓冲溶液流过毛细管所需时间.

ct-DNA 溶液的比黏度以η0表示.以c(配合物)/c(ct-DNA)为横坐标，以(η/η0)1/3为纵坐标作图，分析配合物与DNA 的结合方式.

1.4.4 配合物对pBR322 DNA 的切割作用 将配合物、VC(浓度是配合物的30～70 倍)与pBR322 DNA(200 ng)混合，用Tris-HCl / NaCl 缓冲液定容至20 μL，在37 ℃恒温条件下静置1 h 后，加入3 μL Loading buffer，在8 g·L-1琼脂糖凝胶和TBE 电泳液中，用100 V 电压电泳40 min.用Gold View(4～5 μL)作着色剂，以溴酚蓝为指示剂，在紫外检测仪下观察并拍照.在上述混合体系中分别加入活性氧抑制剂{·OH抑制剂［二甲基亚砜(DMSO)，4μL］、1O2抑制剂［2，2，6，6-四甲基-4-哌啶酮(TMP)、NaN3，100 μmol·L-1］}，通过电泳带的变化探索配合物对质粒DNA 的切割机理.

2 结果与分析

2．1 配合物的组成和结构

配合物1 和配合物2 的化学式、化学元素分析数据和摩尔电导率(Λm)列于表1.

表1 配合物的元素组成分析Tab．1 The elemental analysis of the complex

在室温条件下的甲醇溶液中，配合物1 和配合物2 的摩尔电导率数据表明2 个配合物在甲醇中是1∶1 型电解质［14］.即Cu2+与配体形成的配阳离子与抗衡离子Cl-在甲醇中按1∶1 解离.

配体和配合物的IR 和UV-Vis 光谱数据及其分析指认归纳于表2 中.从表2 可以看出，配体AMB的νN-H在配合物1 和配合物2 中都向低波数方向发生了移动，结合苯并咪唑的νC=C，νC=N和γC-H的峰位变化，说明AMB 的—NH2氮和苯并咪唑环的氮都参与了配位，这与文献［7-9］的报道一致.在配合物2中，虽然νN-H和νO-H重叠在一起，但在1 600 cm-1左右的2 个νC=C，νC=N的峰位相对于配合物1 发生了位移，而且在指纹区出现了3 个中强度的吸收峰，其峰位均低于配体，但又不同于配合物1.由此说明:在配合物2 中phen 和AMB 都与Cu2+发生了配位作用［15］.

表2 配合物与配体的IR 和UV-Vis 吸收峰归属Tab．2 The attribution of the IR ＆ UV-Vis absorption peaks of the complex and the ligand

在UV-Vis 光谱中，配合物1 和配合物2 的甲醇溶液在紫外光区和可见光区出现的吸收峰与文献［8］相近，说明配合物1 和配合物2 也为四方锥构型［7-8］.

综合上述IR、摩尔电导率、UV-Vis 和元素分析结果，配合物1 和配合物2 的分子式分别为:［Cu(AMB)2Cl］Cl·4H2O 和［Cu(AMB)(phen)Cl］Cl·2H2O，推测2 个配合物的配位构型如图1 所示.

2．2 配合物的抑菌活性

图1 推测的配合物1 和配合物2 的分子配位构型Fig.1 Speculated molecular structures of the complex 1 and 2

表3 配合物的抑菌活性Tab．3 The bacteriostatic activity of the complex for the assayed bacteria

配合物1、配合物2 和对照物的最小抑菌浓度见表3.从表3 可以看出:对4 种受试菌种，配合物1 和配合物2 的抑菌活性明显高于CuCl2和AMB，说明AMB配位后与Cu(II)产生协同作用，提高了抑菌活性;配合物2 的抑菌活性虽然比配合物1 高，但是与phen 相近.这可能是phen 配体取代了配合物1 的AMB 后，配合物2 的脂溶性提高且接近于phen 的缘故.这一推测从配合物2 在无水乙醇中的溶解性高于甲醇可以佐证.

2．3 配合物与DNA 的相互作用

2.3.1 紫外光谱 UV 光谱的变化可以反映出配合物与DNA 结合后配体的电子结构受DNA 扰动的情况.当配合物插入DNA 碱基对或与DNA 双螺旋沟槽中的碱基发生非共价结合时，可使π电子跃迁几率减小，会产生减色效应;另外，如果配离子带正电，其易靠近DNA 槽内带负电的磷酸基，使得磷酸生色团内陷，也会降低小分子-DNA 复合体系的紫外吸收.一般地，紫外吸收减色、吸收带红移和等色点的出现是小分子与DNA 发生嵌插作用的光谱标志［16］.配合物1 和配合物2 与ct-DNA 作用的紫外光谱如图2 所示.从图2 可见，随着c(ct-DNA)的增加，配合物1 的紫外光谱只发生了轻微的减色效应，而配合物2 发生了明显的减色并在300 nm 附近出现了等色点.当c(ct-DNA)/c(配合物)=2.1 时，在270 nm 处配合物1 的减色率仅为1.48%，而配合物2 的减色率为18.0%.与DNA 插入剂［Ru(bpy)2L］2+(其中，L=phen、IP 或PIP)的减色率12%～22%［17］比较，推测配合物1 以非插入方式与DNA 结合，而配合物2 以插入方式结合DNA.

2.3.2 荧光光谱 EB 分子中含有三环刚性平面，是弱荧光物质［1］，它可以嵌入DNA 碱基对之间而使荧光显著增强.因此以EB 作为DNA 结构探针，可以研究金属配合物与DNA 的作用方式.当其他分子与DNA 作用，将EB 从DNA 的碱基对中挤出来时，DNA/EB 体系的荧光发生猝灭.配合物1 和配合物2与ct-DNA 作用的荧光光谱见图3.从图3 可以看出，随着c(配合物)的增加，EB-DNA 体系的荧光强度明显下降，说明配合物与EB-DNA 结合后使EB 从复合体系中逸出.

图3 配合物对EB-DNA 体系荧光光谱的影响Fig.3 Effects of the complex on the fluorescence spectra of EB-DNA system

［17］所述方法，按照Stern-Volmer 方程I0/I=1 +Ksqr(I 和I0分别为滴加和未滴加配合物时EB-DNA 体系的荧光强度;r 为配合物与DNA 的浓度比;Ksq为猝灭常数)，以I0/I 对r 作图，获得的直线(图3 中小图)斜率就是Ksq.Ksq越大，说明配合物对EB-DNA 体系的猝灭程度越大，与DNA 的作用越强.试验测得配合物1 和配合物2 对EB-DNA 荧光体系的猝灭常数Ksq分别为0.059 2 和0.135 0，表明2 个配合物均能与ct-DNA 结合，结合强弱顺序为配合物1＜配合物2.这可能是由于配合物2 中配体phen 的刚性环面积大于AMB，疏水作用较强，容易嵌入DNA 碱基对间的缘故.

2.3.3 黏度 黏度法是检测在溶液中配合物与DNA 结合模式的一种有效方法.一般地，如果配合物与DNA 以静电、沟槽结合等非插入方式结合，DNA双链受到的影响很小，则DNA 溶液黏度变化不明显;如果配合物部分插入DNA 碱基对之间，DNA 的双链会发生扭结缩短，则溶液的黏度减小;而如果配合物完全嵌入DNA 碱基对间，DNA 的双链会被拉伸变长，则DNA 溶液的黏度增加［18-19］.随着配合物的加入，ct-DNA 溶液的比黏度变化见图4.从图4 可以看出，随着配合物浓度的增大，配合物1-DNA 复合体系的相对比黏度变化不大，而配合物2-DNA 复合体系的相对比黏度增幅明显.这表明2 个配合物与ct-DNA的结合方式不同:配合物1 以静电或沟槽方式结合，而配合物2 是以插入方式结合.这与前面UV 和荧光光谱的结果吻合.

图4 DNA 的相对比黏度随配合物加入量的变化Fig.4 Effects of increasing amounts of complexes on the relative viscosity of DNA

2.3.4 配合物对pBR322 DNA 的断裂作用 通常pBR322 DNA 有3 种构型:Ⅰ型—超螺旋型(完整的pBR322 DNA);Ⅱ型—环形(1 条链上有一个切口);Ⅲ型—线型(在同一位置2 条链断裂).在电泳时，3种构型的迁移速率存在明显差别，迁移速率大小顺序为:Ⅰ型＞III 型＞Ⅱ型.在恒温37 ℃条件下，配合物1 和配合物2 切割质粒DNA 的琼脂糖凝胶电泳效果见图5.从图5 可见，虽然在还原剂VC存在下，CuCl2、AMB 和phen 对pBR322 DNA 均未显示出切割作用，但2 个配合物却均能将Ⅰ型pBR322 DNA切割成Ⅱ型，切割能力为配合物2＞配合物1.

图5 配合物1 和配合物2 及配体切割pBR322 DNA 的凝胶电泳图(37 ℃)Fig.5 Agarose gel eletrophoresis for the cleavage of pBR322 DNA by the complex1，2 and the ligand at 37 ℃

因Cu2+具有氧化还原性，因此Cu 配合物切割DNA 大多涉及氧化机理［20］.为进一步验证配合物是通过氧化机理切割DNA，在活性氧清除剂DMSO、TMP 或NaN3存在下，测试了配合物1 和配合物2 对pBR322 DNA 的切割作用(图6).

图6 活性氧清除剂存在下配合物1 和配合物2 切割pBR322 DNA 的凝胶电泳图Fig.6 Cleavage of pBR322 DNA by the complex 1 and 2 in the presence of active oxygen scavenging agent

切割机理试验说明，在还原剂VC存在下，配合物1 和配合物2 均能将Ⅰ型pBR322 DNA 切割成Ⅱ型，而在加入·OH 抑制剂DMSO 后，配合物1 和配合物2 对pBR322 DNA 的切割作用明显被抑制(图6泳道3);加入1O2抑制剂TMP 或NaN3后，切割作用基本没有变化，由此推测2 个配合物可能通过羟基自由基氧化机理切割pBR322 DNA.这与文献［8，18-19］结果一致.

3 结论

本文合成了Cu(Ⅱ)-AMB 二元配合物和AMBCu(Ⅱ)-phen 三元配合物，通过元素分析、IR、UV-Vis和摩尔电导率对2 个配合物进行了组成和结构表征，推测2 个配合物的分子式分别为:［Cu(AMB)2Cl］Cl·4H2O(配合物1)和［Cu(AMB)(phen)Cl］Cl·2H2O(配合物2).

光谱法和黏度法的研究结果表明:配合物1 和配合物2 分别以非插入方式和插入方式与ct-DNA结合，结合能力为配合物2＞配合物1.

琼脂糖凝胶电泳试验说明，在VC作用下2 个配合物都可通过·OH 机理断裂pBR322 DNA.

配合物1 和配合物2 对大肠埃希菌、沙门杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的抑制作用高于AMB，配合物2 的MIC 与phen 相近，抑菌活性表现为配合物2＞配合物1.2 个配合物的抑菌活性强弱次序与结合DNA 的强弱次序刚好一致，二者是否存在关联还需深入研究.

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