刘淑云，张 平，林仁勇，张 爽，聂亚雄

（1.广东省深圳市观澜人民医院神经内科，广东 深圳 518110；2.南华大学附属南华医院神经内科，湖南 衡阳 421002；3.南华大学附属第一医院神经内科，湖南 衡阳 421001）

TNF-α预测高血压大鼠发生脑卒中的实验研究

刘淑云1，张 平2，林仁勇1，张 爽1，聂亚雄3

（1.广东省深圳市观澜人民医院神经内科，广东 深圳 518110；2.南华大学附属南华医院神经内科，湖南 衡阳 421002；3.南华大学附属第一医院神经内科，湖南 衡阳 421001）

目的 观察易卒中型肾血管性高血压大鼠（RHRSP）在经历人工寒潮卒中前血浆 TNF-α含量差异，从而探讨 TNF-α能否预测高血压大鼠发生脑卒中。方法 双肾双夹法制作RHRSP模型，经历人工寒潮并于寒潮前取血，酶联免疫吸附测定法检测血浆 TNF-α含量。结果 脑梗死组和脑出血组寒潮前 TNF-α含量明显高于非卒中组，高血压各组血压与 TNF-α成正相关。结论 TNF-α有可能成为预测卒中的分子标志物之一。

脑卒中；易卒中肾血管性高血压大鼠；肿瘤坏死因子；人工寒潮

脑卒中已上升为我国第一位致死致残性疾病。临床上，脑卒中多发生于某些特定人群如高血压、糖尿病患者，但这些具有高危因素的人群，也不是都发生卒中。高血压是脑卒中最重要的独立危险因素，脑卒中发病率、死亡率与血压升高有着十分密切的关系［1-2］。如果能在高血压患者中筛查出易促发卒中的高危人群，并进行及时、有效的干预，无疑是预防脑卒中发作的最佳途径。

目前对高血压患者发生卒中并无足够的预警手段。本研究采用易卒中型肾血管性高血压大鼠（RHRSP）模型，人工模拟自然寒潮诱导高血压大鼠自发脑卒中，通过检测 RHRSP在经历寒潮后的卒中组与非卒中组寒潮前血清 TNF-α含量差异，初步探讨人工寒潮对 RHRSP发生卒中的影响及通过血清中TNF-α的表达差异来预测RHRSP发生卒中的情况。旨在为临床上高血压患者将来易发生相关性脑血管疾病筛选出有效、简便的预测指标，为个体化防治提供“风向标”。

1 材料和方法

1.1 高血压大鼠模型制备 健康雄性 SD大鼠230只（南华大学实验动物部提供），体重80～120 g，鼠龄 60～90 d。200只按既定的双肾双夹法［3］制成RHRSP模型，用“Ω”环形银夹，银丝直径为0.5 mm，环的内径为0.3 mm。术后常规用庆大霉素8 000 U·kg-1腹腔内注射预防感染，术后4～6 h恢复喂食，以颗粒型普通大鼠饲料喂养，饮用自来水，动物房温度控制在20℃左右，光照周期12 h，模拟正常昼夜节律。用鼠尾测压仪（HX-1型），37℃恒温箱预热15 min后，经尾动脉测定收缩压，每只大鼠测3次，取平均值作为该大鼠的血压值。肾动脉狭窄术前测量1次，术后每周测量1次，选取术后12周高血压形成稳定的大鼠进行实验。假手术组30只，造模方法同高血压模型组，但不缩窄肾动脉。

1.2 模拟人工寒潮 人工寒潮前按 Zealonga 5分制评分标准，对大鼠进行神经学评分：0分，无神经损伤症状；1分，不能完全伸展对侧前爪；2分，向外侧转圈；3分，向对侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。人工寒潮前剔除 longa≥1的大鼠，将上述大鼠置于RXZ2300A型智能人工气候箱（宁波江南仪器厂）中，调节相对湿度70%，温度22℃12 h，4℃ 12 h为1 d循环，共3 d。每只大鼠寒潮前舌下静脉取血约1 mL，离心10 min（3 000 r·min-1）分离血浆，分装后 -80℃冰箱保存备用。

1.3 TNF-α含量测定 采用双抗体夹心ELISA法测定TNF-α，酶标仪450 nm处测定OD值，curve-expert 1.3软件作标准曲线，输入各OD值，计算出TNF-α含量。

1.4 大鼠脑组织病理学检查 寒潮结束，将大鼠用 10%水合氯醛（300 mg·kg-1）麻醉，经左心室向升主动脉插管，剪开下腔静脉，同时快速灌注肝素化生理盐水（50 U·mL-1），120 mL（滴速为10 mL ·min-1）以清除血管内血液，断头取脑，-20℃冷冻10 min后将脑切成2 mm厚的冠状薄片，先肉眼观察脑组织有无异常，然后将大鼠脑组织固定于4%的多聚甲醛溶液中 8 h，石腊包埋，连续石蜡切片，切片厚度 5 μm，HE染色，XDS-1B普通显微镜观察脑卒中情况。根据寒潮后镜检结果把RHRSP组分为非卒中组，脑梗死组，脑出血组。见图 1～3。

图1 大鼠脑组织肉眼观察注：RHRSP易卒中型肾血管性高血压大鼠。A：RHSP组脑出血，白色箭头所示为脑出血病灶；B：RHRSP组脑梗死，白色箭头所示为脑梗死病灶，C：假手术组。

图2 大鼠脑组织光镜观察（HE×100）注：RHRSP易卒中型肾血管高血压大鼠。A：RHRSP组脑出血病灶；B：RHRSP组难梗死病灶。

图3 脑小动脉形态（HE）注：RHRSP：易卒中型肾血管性高血压大鼠。A：RHRSP组，黑色箭头示脑内动脉管壁增厚，管腔狭窄；B：假手术组，黑色箭头示正常脑小动脉。

1.5 数据处理和统计分析 应用 SPSS 11.0软件包进行统计学分析，数据用均数±标准差（±s）表示，均为正态资料，寒潮前两组间比较采用t检验；寒潮前血压与 TNF-α水平的的关系采用直线相关分析。

2 结果

2.1 卒中情况 术后RHRSP组因腹部大出血死亡1只，因感染死亡2只，寒潮前 longa≥1的剔除3只，最后经历寒潮的为假手术组30只，RHRSP组为194只。其中假手术组经历寒潮后没有出现脑卒中；RHRSP组有13只发生脑梗死，有 35只发生脑出血，其卒中率为 24.7%，与以往实验研究［5］基本一致。

2.2 各组大鼠寒潮前血压与血浆 TNF-α含量的比较 寒潮前手术组血压高于假手术组血压，有显著性差异（P＜0.001），且卒中组（包括脑出血组和脑梗死组）高于非卒中组（P＜0.001或 P＜0.05）（见图4）。寒潮前手术组 TNF-α含量高于假手术组，有显著性差异（P＜0.001），且卒中组高于非卒中组（P＜0.001），脑出血组TNF-α含量高于脑梗死组，但无显著性差异。具体见表1。

图4 寒潮前各组血压折线图注：大鼠数值（非卒中组将血压一致的所有大鼠为一个值，146只共分成32个值，假手术组、脑出血组及脑梗死组为实际的大鼠只数）。

表1 各组寒潮前例数、血压及血浆 TNF-α含量的比较

2.3 寒潮前血压与 TNF-α水平的的关系 寒潮前手术组各组 TNF-α与血压成正相（P＜0.01），见表2。

表2 寒潮前血压与 TNF-α水平的关系

3 讨论

现有脑卒中模型大多采用正常动物，与临床脑血管病变基础上发生的卒中有明显差异。本研究前期工作显示，采用双肾双夹法制作的 RHRSP模型，2周后血压明显升高，以后血压逐渐升高，术后12周血压高达（215±24）mmHg以上，病理检查发现RHRSP脑内动脉硬化、管壁增厚及管腔狭窄，甚至血管破裂出血［4］；造模 40周自发性脑卒中的发生率高达61.8%，模拟了从高血压发生到脑血管结构性破坏以及脑卒中的整个病理过程［3］。高血压持续 12周后经历人工寒潮，其卒中发生率为24.5%，其中脑出血占27%，脑梗死占73%。说明该模型经历人工寒潮可以模拟高血压患者在天气变化时发生脑卒中，有利于进一步研究气象因素促发脑卒中的机制以及预防。

近年来研究表明，炎性机制在高血压及脑卒中病理病生过程中扮演一个重要的角色。TNF-α是由激活的巨噬细胞分泌的一种免疫细胞因子，又是一种重要的炎性细胞因子，在触发高血压炎症反应中处于中心地位［5］。更为重要的是TNF-α有促动脉硬化形成，损伤小动脉，介导凋亡机制诱导神经细胞凋亡［6-7］，所以 TNF-α还参与脑血管病的诱发过程并影响病程，是缺血性脑卒中复发的强力预测因子［8］。本文研究显示：寒潮前手术组TNF-α含量高于假手术组，且卒中组高于非卒中组（P＜0.001），脑出血组 TNF-α含量高于脑梗死组，但差异无显著性。而TNF-α抑制剂可以透过血脑屏障，减少脑梗死面积，可能是减少卒中并发症一条新途径［7，9］。

我们进一步对高血压各组血压与 TNF-α做简单相关分析发现：寒潮前手术组各组 TNF-α与血压成正相关。而且血压越高，这种变化就越明显。TNF-α升高使得血管收缩和舒张不平衡；同时高血压又能造成 TNF-α的过量释放，进而形成互相促进的恶性循环［10］。无论是缺血性卒中还是脑出血的发病过程中都存在着 TNF-α介导的炎症免疫反应，其中 TNF-α在这一过程中可能起关键作用。

综上所述，持续高血压使RHRSP血中的TNF-α明显升高，且增加脑内动脉粥样硬化风险。这些变化达到一定程度时在寒潮的刺激下便发生脑卒中，达到这种程度可以从 TNF-α的含量上反映，即TNF-α的含量达到一定程度 RHRSP在寒潮的刺激下发生脑卒中。我们的研究发现无论发生脑梗死还是脑出血的RHRSP寒潮前血中TNF-α的含量都较非卒中组明显升高，且两者的 TNF-α的含量随血压的升高而升高。提示持续的 TNF-α升高对高血压患者发生脑卒中可能具有一定的预警作用。

但是 RHRSP经历人工寒潮为什么一部分发生脑梗死而又有一部分发生脑出血呢，这需要我们进一步研究。

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Tumor necrosis factor-α could be used as the prediction index of stroke in hypertensive rats

LIU Shu-yun1，ZHANG Ping2，LIN Ren-yong1，et al
（1.Guanlan People’s Hospital of Neurology，Shenzhen，Guangdong 518110，China；2.Department of Neurology，Nanhua Affiliated Hospital of Nanhua University，Hengyang，Hunan 421002，China）

Objective To investigate changes of serum tumor necrosis factor-α（TNF-α）in stroke-prone renovascular hypertensive rats （RHRSP）before artificial cold and the possible prediction value of TNF-α.Methods Two-kidney，two-clip methods were used to copy the model of renovascular hypertension in rats.The levels of serum TNF-α were measured by enzyme-linked immunosorbant assay before artificial cold.Results The serum levels in cerebral infarction group and cerebral hemorrhage group were significantly higher than those in the non-stroke group before artificial cold；the contents of TNF-α in hypertension groups positively correlated with blood pressure.Conclusions The serum TNF-α levels could be used as the prediction index of stroke.

stroke；stroke-prone renovascular hypertensive rats；tumor necrosis factor-α；artificial cold

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.03.018

2013-08-25，

2013-10-30）

湖南省自然科学基金（No 08JJ3036）

聂亚雄，男，主任医师，硕士生导师，研究方向：脑血管病防治，E-mail：bridgeman1025＠yahoo.com.cn