孙文洪，何金花，韩泽平，黄国贤，朱丽梨，何琨仪，陈炳豪

（广东省广州市番禺区中心医院检验科，广东 广州 511400）

Hsa-miR-204反义核酸提高MOLT-4细胞对苦参碱的敏感性研究

孙文洪，何金花，韩泽平，黄国贤，朱丽梨，何琨仪，陈炳豪

（广东省广州市番禺区中心医院检验科，广东 广州 511400）

目的 研究 miR-204的反义核酸（anti-miR204 oligonucleotides，AMO-miR-204）联合苦参碱观察其对人急性淋巴细胞白血病细胞株（MOLT-4）生长与凋亡的影响及机制。方法 将一定浓度的人工合成的 AMO-miR-204经脂质体包裹转染 MOLT-4细胞，并联合不同浓度的苦参碱作用于MOLT-4细胞48 h后，采用MTT法检测单用 AMO-miR-204、单用苦参碱及 AMO-miR-204联合苦参碱对MOLT-4细胞增殖抑制作用，流式细胞术检测细胞早期凋亡率；实时荧光定量RT-PCR检测细胞 Bcl-2mRNA的表达水平；克隆形成抑制实验检测克隆形成能力。结果 单用苦参碱的 IC50为0.75 mg·L-1；苦参碱与阴性对照联合使用，IC50为 0.29 mg·L-1，表现为相加作用；苦参碱与 AMO-miR-204联合使用，IC50为 0.07 mg·L-1，增敏倍数为 10.7，表现为协同作用。流式细胞术结果显示：联合组比单用组早期凋亡率明显增高，凋亡率达25.4%。单用AMO-miR-204、苦参碱及两者联均能下调 Bcl-2mRNA基因的表达水平，对 MOLT-4细胞克隆形成逐渐减小，其中两者联合的克隆数为（28±3.0）。结论

AMO-miR-204可提高MOLT-4细胞对苦参碱的敏感性，其机制可能为通过下调Bcl-2 mRNA的表达水平，促进MOLT-4细胞早期凋亡，并抑制其克隆形成有关。

Hsa-miR-204；反义核苷酸；急性淋巴细胞白血病；苦参碱

有研究表明 microRNA-204（miR-204）在急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）细胞中表达上调，并扮演癌基因的角色［1］。在前期的研究中，设计针对成熟hsa-miR-204的反义寡核苷酸（anti-miR204 oligonucleotides，AMO-miR-204），并通过脂质体转染ALL细胞，结果表明 AMO-miR-204能有效抑制 MOLT-4的增殖能力，并促进其凋亡。苦参碱是中药苦参、山豆根和苦豆子的主要成分，经临床证实苦参碱可抑制机体的炎症反应［2］，并具有抗肿瘤生长的作用［3］。本研究旨在运用AMO-miR-204联合苦参碱作用于人急性淋巴细胞白血病细胞株（MOLT-4），观察其对 MOLT-4细胞的生长与凋亡的影响，为临床上急性淋巴细胞白血病的中西医结合治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂 RPMI-1640培养基（Hyclone公司）；LipofectamineTMRNAiMAX转染试剂（invitrogen公司）；Opti-MEM培养基（Gibco公司）；cellTiter96AQ单溶液细胞增殖检测试剂（Promega公司）；酶标仪（Thermo Fisher Scientific公司）；Annexin VFITC细胞凋亡检测试剂盒（keygen公司）；流式细胞仪（BD公司）；苦参碱注射液（国药准字号：H10950071）购自西安东华生物工程技术有限责任公司。

1.2 细胞株与反义寡核苷酸序列的设计与合成人急性淋巴母细胞白血病细胞株（MOLT-4），由广州莱德尔生物技术有限公司提供。miR-204成熟序列为5’-UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU-3’，设计AMO-miR-204序 列 为 5’-AGGCATAGGATGACAAAGGGAA-3’，均由广州莱德尔生物技术有限公司合成。

1.3 细胞培养及转染 转染前1 d对细胞进行传代，使其汇合度为 30% ～50%，转染采用 LipofectamineTMRNAiMAX转染试剂，转染micoRNA的mimics浓度为50 nm，转染时使用 Opti-MEM培养基。取对数生长期生长良好的MOLT-4细胞，0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞，悬浮调整细胞浓度为1×105／mL。用OPTI-MEM培养基稀释AMO-miR-204至0.6 μmol·L-1。将上述两种稀释液充分混匀，室温孵育10 min。将 MOLT-4细胞重新混悬，按所需量加入转染试剂中，轻柔震荡使细胞分散均匀。

1.4 MTT法检测细胞增殖抑制率 0.25%胰蛋白酶消化细胞后吹打散均匀，以每孔 1×104个细胞接种96孔板，添加含10%FBS的RPMI-1640培养液，置于 37℃、5%CO2细胞培养箱培养。待细胞生长基本汇合后，将培养液弃去，加入无血清培养基，继续培养24 h。按实验分组：（1）对照 （control）组；（2）NC（negative control，阴性对照组，含随机序列及脂质体）；（3）AMO-miR-204组 （终浓度600 nmol·L-1）；（4）苦参碱组；（5）苦参碱组联合AMO-miR-204组（苦参碱终浓度0.2、0.4、0.6、1.6、3.2 g·L-1）。置入培养箱培养约 48 h，每孔加50 μL MTT溶液，置入孵箱孵育4 h。吸出上清液，每孔加150 μL DMSO，溶解颗粒，用平板摇床摇匀。用酶标仪在490 nm处测每孔的光密度，进而计算细胞增殖抑制率，公式为：增殖抑制率 ＝（对照组吸光度 -实验组吸光度）／对照组吸光度×100%。

1.5 Annexin V-FITC／PI双染色法检测细胞凋亡

以1.0×106／孔的密度将人 MOLT-4细胞接种12孔培养板，每孔 1 mL。实验分组：（1）对照 （control）组；（2）NC组（终浓度 600 nmol·L-1）；（3）AMO-miR-204组 （终浓度600 nmol·L-1）；（4）苦参碱组（终浓度1.6 g·L-1）；（5）苦参碱组联合AMO-miR-204组（AMO-miR-204终浓度 600 nmol ·L-1）。培养48 h后，消化收集细胞，采用试剂盒提供的染色缓冲液重悬，加入FITC-AnnexinV试剂和 PI试剂，避光孵育 15 min，加入 200 μL染色缓冲液，流式细胞仪检测各组细胞早期凋亡率，实验重复3次，计算均值。

1.6 实时荧光定量 RT-PCR检测 bcl-2 mRNA的相对表达水平 以 1.0×106／孔的密度将人 MOLT-4细胞接种于 12孔板，总体积 1 mL，细胞分组同上。12 h后加入 AMO-miR-204混合物，培养 48 h后，消化收集各组细胞，TRizol试剂提取RNA。采用 M-MLV逆转录酶逆转录为cDNA。作为 PCR反应的模版，bcl-2上游引物：5’-TCATGTGTGTGGAGAGCGTC-3’，下游引物：5’-AGCCTCCGTTATCCTGGATC-3’，扩增片段大小117 bp。18S上游引物：5’-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3’，下游引物：5’-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3’，扩增片段大小 112 bp。取模板 DNA采用 SYBRgreen掺入法进行荧光定量 PCR反应，条件如下：95℃5 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 32 s共40个循环，所有的样本检测均包含一个不加模板的阴性对照，以排除假阳性的结果。运用计算 2-△△Ct值来比较对照组和实验组的目的基因 mRNA相对表达量的差异。

1.7 克隆形成抑制试验 取对数生长期MOLT-4细胞，用含15%血清的培养液调细胞密度为 3×102个／mL，接种于12孔板，每孔1 000 μL，每组2复孔。细胞分组同上。转染后置37℃，5%CO2，饱和湿度条件培养箱内孵育7 d，吸去培养液，PBS洗涤，甲醇∶冰醋酸（3∶1）固定液固定 10 min，吉姆萨染色30 min后流水冲洗，倒置显微镜下计数细胞克隆（＞20个细胞记一个克隆）并拍照，克隆形成抑制率＝（对照组细胞克隆数-实验组细胞克隆数）／对照组细胞克隆数×100%。

1.8 统计学分析 应用 SPSS13.0统计软件处理数据，计量资料以均数、标准差（±s）表示，均通过正态性检验。多组间的比较采用完全随机设计的单因素方差分析（one-way ANOVA）分析，各组间两两比较为 LSD检验。P值小于0.05示有统计学意义。

运用金正均 Q值法计算AMO-miR-204与苦参碱联合使用的效果Q＝Ea+b／（Ea+Eb-Ea×Eb），Ea和Eb分别为单用 AMO-miR-204和单用苦参碱的抑制率，Ea+b为两者联合用药的抑制率。式中分子代表“实测合并效应”，分母是“期望合并效应”，Q值是两者之比，Q＜0.85为拮抗，0.85≤Q＜1.15为相加，Q≥1.15为协同作用。药物增敏倍数 ＝单纯用药组的 IC50／合用药组的 IC50。

2 结果

2.1 AMO-miR-204联合苦参碱对 MOLT-4细胞增殖的影响 单用苦参碱的IC50为 0.75 mg·L-1；苦参碱与阴性对照联合使用，IC50为 0.29 mg·L-1，表现为相加作用（0.85≤Q＜1.15）；苦参碱与 AMO-miR-204联合使用，IC50为0.07 mg·L-1，增敏倍数为10.7，表现为协同作用（Q≥1.15）。见表1。

表1 AMO-miR-204联合苦参碱对MOLT-4细胞增殖抑制率

图1 Annexin V-FITC／PI双染色法检测细胞早期凋亡率

2.2 Annexin V-FITC／PI双染色法检测细胞早期凋亡率 单用AMO-miR-204、苦参碱作用于MOLT-4细胞48 h后，均能诱导细胞早期凋亡，与NC组（阴性对照组）以及空白对照 （control）组相比，没有明显统计学差异（P＞0.05）；但两者联合组比单用组早期凋亡率明显增高，凋亡率达25.4%，与 NC组（阴性对照组）以及空白对照（control）组相比，未有明显统计学差异（P＜0.05，图1）。

2.3 AMO-miR-204联合苦参碱bcl-2 mRNA的相对表达水平的影响 单用 AMO-miR-204、苦参碱及两者联合作用于 MOLT-4细胞 48 h后，均能下调Bcl-2基因的表达水平。其中联合组较明显，说明两者通过下调 Bcl-2基因的表达水平从而抑制 MOLT-4细胞的增殖（图 2）。

图2 AMO-miR-204联合苦参碱bcl-2 mRNA的相对表达水平的影响

2.4 AMO-miR-204联合苦参碱对 MOLT-4细胞克隆形成的影响 与空白对照组比较，阴性对照组未见明显差异。而 AMO-miR-204、苦参碱组对MOL-4细胞克隆形成逐渐减小，与空白对照组、阴性对照组比较，有统计学意义（P＜0.05）。当 MO-miR-204联合苦参碱时，对 MOL-4细胞克隆形成的数明显减少，与空白对照组、阴性对照组比较，具有统计学意义（P＜0.05）。结果表明 AMO-miR-204联合苦参碱通过抑制对MOLT-4细胞克隆的形成抑制细胞增殖（图3）。

图3 AMO-miR-204联合苦参碱对MOLT-4细胞克隆形成的影响

3 讨论

急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是儿童最常见的恶性肿瘤，近几年儿童ALL的长期无病存活率明显提高，部分发达国家已达80%，但仍有约20%的患儿复发死亡［4］。如何防止复发，避免不必要的过度化疗一直是儿科血液肿瘤研究者期待解决的问题［5］。Hsa-miR-204在ALL中表现为上调，Hsa-miR-204在ALL中扮演癌基因的角色。Hsa-miR-204首次被发现与恶性血液病相关。当miRNA在肿瘤中高表达时，导入与其互补的反义寡核苷酸序列，使其表达降低，从而可以调节肿瘤基因表达水平的角度来实现治疗肿瘤的目的，该方法被认为可能是目前抑制miRNA活性最好而且最实际的方法［6-7］。传统中药苦参碱是从苦参根及苦豆子中提取的一种生物碱，关于苦参碱诱导白血病细胞凋亡及其机制的研究主要集中于髓系白血病领域。苦参碱可抑制髓系白血病 K562细胞和 L1210细胞的增殖、诱导其凋亡，苦参碱诱导多种肿瘤细胞凋亡这一药学特性倍受研究者们的关注［8］。因此，本研究以 Hsa-miR-204为切入点设计了这一实验，利用Hsa-miR-204的反义核酸AMO-miR-204联合苦参碱共同作用于急性淋巴细胞白血病细胞株MOLT-4，观察其对MOLT-4细胞的增抑制殖作用，为临床上急性淋巴细胞白血病的中西结合治疗提供理论依据。

在本研中单用苦参碱的 IC50为0.75 mg·L-1；苦参碱与阴性对照联合使用，IC50为 0.29 mg·L-1，表现为相加作用（0.85≤Q＜1.15）；苦参碱与AMO-miR-204联合使用，IC50为 0.07 mg·L-1，增敏倍数为10.7，表现为协同作用（Q≥1.15）。进一步运用RT-PCR检测AMO-miR-204联合苦参碱Bcl-2 mRNA的相对表达水平的影响。结果显示：AMO-miR-204、苦参碱及两者联合作用于MOLT-4细胞48 h后，均能下调 Bcl-2基因的表达水平。其中联合组较明显，说明两者通过下调 Bcl-2基因的表达水平从而抑制 MOLT-4细胞的增殖。同时流式细胞术结果表明两者联合具有明显的促进细胞早期凋亡的作用。

综上所述，AMO-miR-204可提高 MOLT-4细胞对苦参碱的敏感性，其机制可能为通过下调 Bcl-2 mRNA的表达水平，促进 MOLT-4细胞早期凋亡，并抑制其克隆形成有关。总之，本研究数据为急性淋巴细胞白血病的中西医治疗提供了参考依据，其临床实际应用前景与潜力值得进一步深入研究。

［1］ 郝 莉，孙国平.miRNA作为大肠癌生物标志物的研究进展［J］.安徽医药，2013，17（2）：183-185.

［2］ 梁建新，屈杏芬，曾文铤，等.氧化苦参碱在治疗慢性乙型肝炎中抗肝纤维化的作用机制［J］.南方医科大学学报，2010，30 （8）：1871-1873.

［3］ 朱晓伟，宝金荣，布 仁.苦参碱和氧化苦参碱抗肿瘤作用机制研究进展［J］.化学试剂，2010，32（1）：32-36.

［4］ 叶 丽，虞国慧，潘 明，等.左旋门冬酰胺酶治疗急性淋巴细胞白血病不良反应［J］.安徽医药，2011，15（3）：365-366.

［5］ 郭 宇.复方苦参注射液用于急性白血病辅助化疗的观察［J］.中医临床研究，2011，3（16）：98，100.

［6］ Schaefer A，Jung M，Kristianscn G，et al.MicroRNAs and cancer：current state and future perspectives in urologic oncology［J］.Urol Oncol，2010，28（1）：4-13.

［7］ Christine C.Inhibition of microRNA with antisense oligonucleotides［J］.Methods，2008，44（1）：55-60.

［8］ 张春雷，周小梅，吕 琪，等.苦参碱诱导淋巴细胞白血病 L1 210细胞凋亡的实验研究［J］.现代中西医结合杂志，2010，19 （13）：1580-1581.

AMO-miR-204 antisense oligonucleotides enhance the sensitivity of MOLT-4 cells to matrine

SUN Wen-hong，HE Jin-hua，HAN Ze-ping，et al
（Department of Laboratory Tests，Panyu Center Hospital，Guangzhou 511400，China）

Objective To study the effect of antisense oligonucleotides targeted on has-miR-204（anti-miR204 oligonucleotides，AMO-miR-204）for enhancing the matrine sensitivity of acute lymphoblastic leukemia cells and its possible acting mechanism.Methods Dosing and chemosynthetic antisense oligonucleotides targeted on has-miR-204 was transfected to the cells using Lipofectamine TM 2000 and combined with different concentrations of matrine.The inhibitory effects of matrine and AMO-miR-204，used singly or in combination，on cell proliferation were detected by MTT and clone formation assay.The expression of Bcl-2 mRNA was analyzed by real time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction.The percentage of apoptosis cells was determined by flow cytometry.Results Used in combination with AMO-miR-204，the IC50of matrine could be lowered from 0.75 mg·L-1to 0.07 mg·L-1，and the sensitivity of cells to procyanidin increased to 10.7.The amount of apoptotic cells increased significantly.The early apoptotic rate was 25.4%.Transfection with AMO-miR-204 alone or combind with matrine could down-regulate the expression of Bcl-2 mRNA in cells.The colon formation ability was decreased.Conclusions Combined use of AMO-miR-204 could increase the sensitivity of MOLT-4 cells to matrine.The mechanism may be to promote MOLT-4 cells early apoptosis and down-regulate the expression of Bcl-2 mRNA，which provides a novel potential approach for treatment of acute lymphoblastic leukemia.

Hsa-miR-204；antisense oligonucleotides；acute lymphoblastic leukemia；matrine

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.03.009

2013-11-12，

2013-12-06）

广东省中医药管理局项目（No 20121018）