赵建云+邓展进+刘瑞珍

[摘要] 目的 研究大麻素CB2受体激动剂HU308对脂多糖（LPS）诱导小胶质细胞激活后NO及IL-6分泌的影响。 方法 体外培养小鼠小胶质细胞株（BV-2细胞），分为对照组、LPS刺激组及干预组（LPS+HU308）。通过显微镜观察各组小胶质细胞的形态学变化，CCK-8法检测各组小胶质细胞的增殖情况，Griess法检测各组NO含量，ELISA法检测各组IL-6水平。 结果 LPS刺激组的小胶质细胞中出现大量胞体增大，伪足粗短或消失的细胞和一些坏死细胞，细胞增殖较差，NO及IL-6表达水平显著增高。经大麻素CB2受体激动剂HU308干预后，大部分细胞胞体稍大，伪足尚明显，细胞破坏程度轻，增殖较好，炎性因子表达均明显下降。 结论 激动小胶质细胞表面的大麻素CB2受体，可以减轻LPS造成的小胶质细胞过度活化或损伤，抑制其炎性因子N0及IL-6的分泌，从而达到中枢神经系统炎性损伤后的神经保护作用。

[关键词] 大麻素CB2受体激动剂；HU308；脂多糖；小胶质细胞；NO；IL-6

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）05-36-04

脑血管病继发脑损伤，炎症反应起着重要作用[1]。小胶质细胞是中枢神经系统重要的免疫细胞，在脑内起着免疫监视和免疫防御功能[2]，并且对中枢神经系统有支持、营养、保护和修复等重要作用[3]。正常情况下，小胶质细胞处于相对静息状态，在中枢神经系统缺血、缺氧时可迅速被激活，大量分泌炎症因子、一氧化氮（nitric oxide，NO）等分子，参与中枢神经损伤的病理发展过程[4]。因此，抑制小胶质细胞活化后的炎症反应可以作为治疗脑血管疾病脑损伤的重要途径之一[5-6]。内源性大麻素系统神经保护作用成为当今研究的热点问题。激动内源性大麻素受体（CB1＼CB2）可减轻动物模型局灶性脑缺血和全脑缺血造成的脑损伤[7]，但具体机制尚不明确。大麻素CB2受体在中枢神经系统主要表达在小胶质细胞[8]。本实验预通过体外培养小胶质细胞；研究CB2受体激动剂HU308对脂多糖造成的小胶质细胞过度活化或损伤后炎症因子NO、IL-6表达的影响；探讨激动小胶质细胞表面的CB2受体，对小胶质细胞形态功能及炎症反应的影响，为神经保护类药物的研发提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

小鼠小胶质细胞（江阴康众康民生物医药技术公司）；胎牛血清（四季青，浙江天杭生物科技有限公司）；DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、青链双抗、脂多糖（博士德生物公司）；IL-6 ELISA试剂盒（上海西唐生物科技有限公司）；CCK-8试剂盒及Griess法NO检测试剂盒（碧云天生物技术研究所）；HU-308（Cayman Chemical，美国）。

1.2 细胞培养

小胶质细胞株BV2购于江阴康众康民生物医药技术公司。培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液（含青霉素100 U/mL 和链霉素100mg/mL）中，在37℃、5%CO2 恒温孵箱中培养，细胞呈单层贴壁生长，进行常规培养和传代。当细胞密度达80%左右时收集细胞，细胞以4×104～5×104/孔接种于培养板。

1.3 实验分组与处理

实验分为正常对照组、LPS刺激组（LPS浓度为1?g/mL）、LPS联合HU308干预组（LPS浓度1?g/mL，HU308浓度分别1?mol/L、5?mol/L、10?mol/L）。上述五组均干预12h。

1.4 镜下观察

倒置相差显微镜10×20倍镜下观察各组小胶质细胞的形态变化。

1.5 CCK-8法检测细胞增殖

应用96孔细胞培养板检测细胞增殖，每孔加入培养基200?L约10000个细胞，经实验分组与干预12h后，各孔加入20?LCCK-8溶液，在细胞培养箱内继续孵育2h后用酶标仪检测，450nm测定各孔吸光度值。

1.6 Griess 法检测NO的含量

按照说明书Griess 法检测NO的含量。取各组细胞培养上清液50μL加入96孔平底酶标板中，每组设6个复孔，依次加入氨基苯磺酸、萘基乙二胺，室温避光孵育10min，酶标仪540nm 波长读取A值，再依据标准曲线计算出NO的含量（浓度）。

1.7 ELISA法检测细胞培养上清IL-6含量

按照试剂盒说明书推荐方法测定。根据说明书要求配制标准品液、10×标本稀释液及洗涤液。收集细胞培养上清液，96孔酶标板中每孔各加入标准品或待测样品100μL，将反应板充分混匀后置37℃40min，用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，向滤纸上印干；每孔加入蒸馏水和第一抗体工作液各50μL（空白除外），将反应板充分混匀后置37℃20min，同前洗板；每孔加酶标抗体工作液100μL。将反应板置37℃10min，同前洗板；每孔加入底物工作液100μL，置37℃暗处反应15min；每孔加入100μL终止液混匀；30min内用酶标仪在450nm处测吸光值。以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0pg/mL为横坐标，OD值为纵坐标，使用软件作图，画出标准曲线。计算出相应IL-6含量。

1.8 统计学分析

实验数据应用SPSS16.0统计软件分析。以（）表示统计数据，组间比较应用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 倒置相差显微镜观察各组小胶质细胞的形态变化

正常对照组细胞体呈圆形或椭圆形，从胞体发出细长的突起，表面有许多小棘突，细胞密度较高；见图1。LPS刺激组刺激小胶质细胞12h后观察大量胞体增大，伪足粗短或消失，可见一些坏死细胞，细胞密度较低；见图2。与LPS刺激组比较，LPS联合HU308 10?mol/L干预组，干预12h后观察大部分细胞胞体稍大，伪足尚明显，细胞破坏程度轻，密度较高。见图3。endprint

2.2 HU308对LPS诱导的小胶质细胞增殖的影响

表1值结果显示，LPS刺激组细胞增殖较差，与正常对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。HU308不同浓度干预组细胞增殖较好，浓度为10?mol/L的HU308组细胞增殖最好，各组与LPS刺激组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。HU308对损伤的小胶质细胞有保护作用。

2.3 HU308对LPS诱导的小胶质细胞炎症因子（NO、IL-6）分泌的影响

表1结果显示，LPS刺激组的细胞培养液中NO及IL-6含量显著升高，与正常对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。HU308不同浓度干预组细胞培养液中NO及IL-6含量明显降低，浓度为10?mol/L的HU308组NO及IL-6含量降低最明显，与LPS刺激组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。各组间两两比较差异均有统计学意义。HU308对损伤小胶质细胞NO及IL-6的分泌有抑制作用。

3 讨论

小胶质细胞是中枢神经系统最重要的固有免疫细胞和主要效应细胞，一般认为，它来源于单核巨噬细胞系，生理条件下静息状态的小胶质细胞呈分枝状，仅进行简单的吞噬作用，清除代谢产物，其活性受神经元产生的抑制因子如CD200R、CX3CR1 等调控[9]。当中枢神经系统发生损伤后，小胶质细胞迅速活化，其形态呈阿米巴样改变，具有抗原提呈、调理吞噬及分泌炎性因子的作用[10]。脑损伤、低氧、缺血以及神经系统退行性疾病（AD 和PD），常伴随着脑内炎症的出现。小胶质细胞激活经常被认为是神经元凋亡的前期标志[11]。活化后的小胶质细胞可通过释放炎性因子等对神经元具有损伤作用[12]。

近些年对内源性大麻素系统（endocannabinoid system，ECS）的研究成为一个热点。研究发现，ECS由内源性大麻素、大麻素受体及大麻素生物合成和降解的酶系组成。体内存在两种大麻素受体，即CB1受体和CB2受体[13-14]。CB1受体主要分布在脑、脊髓及外周神经系统中，发挥止痛、镇静，参与调控摄食、脂肪聚集及胰岛素抵抗等作用；CB2受体在免疫组织中有丰富的表达，脾脏边缘区、免疫细胞、扁桃体、胸腺等，起免疫调节及抗炎作用[15-17]。近年大麻素类药物在临床应用中出现了成瘾、抑郁或焦虑等中枢神经系统不良反应，考虑与CB1受体有关，部分药物已被叫停。因此，学者们开始更关注对CB2受体的研究。CB2受体在中枢神经系统主要表达在小胶质细胞[18-19]。本实验发现LPS可引起小胶质细胞活化或损伤，分泌炎性因子NO及IL-6明显增多；给予CB2受体激动剂HU308处理后，可以减轻小胶质细胞的损伤，NO及IL-6分泌也显著减少，且有剂量依赖性；这一结果证明激动小胶质细胞CB2受体可以对其起保护作用，并且抑制炎症反应，从而可能发挥神经保护作用。

综上所述，激动大麻素CB2受体，可以对损伤的小胶质细胞起保护作用，抑制其过度活化及炎症反应，从而达到神经保护作用。此研究可以为神经保护类药物的研发提供新的思路和理论基础。

[参考文献]

[1] Lindsberg PJ，Grau AJ.Inflammation and infections as risk factors for ischemic stroke[J].Stroke，2003， 34（10）：2518-2532.

[2] Minagar A，Shapshak P，Fujimura R，et al.The role of macrophage/microglia and astrocytes in the pathogenesis of three neurologic disorders：HIV-associated dementia，Alzheimer disease，and multiple sclerosis[J]. Journal of the Neurological Sciences，2002，202（1）：13-23.

[3] Kettenmann H，Hanisch U K，Noda M，et al.Physiology of microglia[J].Physiological Reviews，2011，91（2）：461-553.

[4] Luo XG，Ding JQ，Chen SD.Microglia in the aging brain： relevance to neurodegeneration[J]. Mol Neurodegener， 2010，5（1）：12.

[5] Giovannini MG，Scali C，Prosperi C，et al.β-Amyloid-Induced Inflammation and Cholinergic Hypofunction in the Rat Brain in Vivo：Involvement of the p38MAPK Pathway[J].Neurobiology of Disease，2002，11（2）：257-274.

[6] van Rossum D，Hanisch UK.Microglia[J].Metabolic brain disease，2004，19（3-4）：393-411.

[7] Bonfils PK，Reith J，Hasseldam H，et al.Estimation of the hypothermic component in neuroprotection provided by cannabinoids following cerebral ischemia[J].Neurochemistry International，2006，49（5）：508-518.endprint

[8] Gifford AN，Samiian L，Gatley SJ，et al.Examination of the effect of the cannabinoid receptor agonist， CP 55，940，on electrically evoked transmitter release from rat brain slices[J].European Journal of Pharmacology，1997，324（2）：187-192.

[9] Noda M，Doi Y，Liang J，et al.Fractalkine attenuates excito-neurotoxicity via microglial clearance of damaged neurons and antioxidant enzyme heme oxygenase-1 expression[J].Journal of Biological Chemistry，2011，286（3）：2308-2319.

[10] 王均辉，孙峰，于常海，等.异常活化的小胶质细胞的特征与功能[J].生理科学进展，2008，39（1）：37-42.

[11] Perry VH，Nicoll JAR，Holmes C.Microglia in neurodegenerative disease[J].Nature Reviews Neurology，2010，6（4）：193-201.

[12] Takeuchi H，Jin S，Wang J，et al.Tumor necrosis factor-α induces neurotoxicity via glutamate release from hemichannels of activated microglia in an autocrine manner[J].Journal of Biological Chemistry，2006， 281（30）：21362-21368.

[13] Herkenham M，Lynn AB，Little MD，et al.Cannabinoid receptor localization in brain[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，1990，87（5）：1932-1936.

[14] Munro S，Thomas KL，Abu-Shaar M. Molecular characterization of a peripheral receptor for cannabinoids[J].Nature，1993，365：61-65.

[15] Galiègue S，Mary S，Marchand J，et al. Expression of central and peripheral cannabinoid receptors in human immune tissues and leukocyte subpopulations[J].European Journal of Biochemistry，1995，232（1）： 54-61.

[16] Ashton JC，Friberg D，Darlington CL，et al.Expression of the cannabinoid CB2 receptor in the rat cerebellum： an immunohistochemical study[J].Neuroscience Letters，2006，396（2）：113-116.

[17] Howlett AC，Johnson MR， Melvin LS， et al. Nonclassical cannabinoid analgetics inhibit adenylate cyclase： development of a cannabinoid receptor model[J].Molecular Pharmacology，1988，33（3）：297-302.

[18] Cs?lle C，Sperlágh B.Peripheral origin of IL-1β production in the rodent hippocampus under in vivo systemic bacterial lipopolysaccharide（LPS）challenge and its regulation by P2X（7） receptors[J].Journal of Neuroimmunology，2010，219（1）：38-46.

[19] Pertwee RG.Pharmacological actions of cannabinoids[M]//Cannabinoids.Springer Berlin Heidelberg，2005： 1-51.

（收稿日期：2014-01-02）endprint

[8] Gifford AN，Samiian L，Gatley SJ，et al.Examination of the effect of the cannabinoid receptor agonist， CP 55，940，on electrically evoked transmitter release from rat brain slices[J].European Journal of Pharmacology，1997，324（2）：187-192.

[9] Noda M，Doi Y，Liang J，et al.Fractalkine attenuates excito-neurotoxicity via microglial clearance of damaged neurons and antioxidant enzyme heme oxygenase-1 expression[J].Journal of Biological Chemistry，2011，286（3）：2308-2319.

[10] 王均辉，孙峰，于常海，等.异常活化的小胶质细胞的特征与功能[J].生理科学进展，2008，39（1）：37-42.

[11] Perry VH，Nicoll JAR，Holmes C.Microglia in neurodegenerative disease[J].Nature Reviews Neurology，2010，6（4）：193-201.

[12] Takeuchi H，Jin S，Wang J，et al.Tumor necrosis factor-α induces neurotoxicity via glutamate release from hemichannels of activated microglia in an autocrine manner[J].Journal of Biological Chemistry，2006， 281（30）：21362-21368.

[13] Herkenham M，Lynn AB，Little MD，et al.Cannabinoid receptor localization in brain[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，1990，87（5）：1932-1936.

[14] Munro S，Thomas KL，Abu-Shaar M. Molecular characterization of a peripheral receptor for cannabinoids[J].Nature，1993，365：61-65.

[15] Galiègue S，Mary S，Marchand J，et al. Expression of central and peripheral cannabinoid receptors in human immune tissues and leukocyte subpopulations[J].European Journal of Biochemistry，1995，232（1）： 54-61.

[16] Ashton JC，Friberg D，Darlington CL，et al.Expression of the cannabinoid CB2 receptor in the rat cerebellum： an immunohistochemical study[J].Neuroscience Letters，2006，396（2）：113-116.

[17] Howlett AC，Johnson MR， Melvin LS， et al. Nonclassical cannabinoid analgetics inhibit adenylate cyclase： development of a cannabinoid receptor model[J].Molecular Pharmacology，1988，33（3）：297-302.

[18] Cs?lle C，Sperlágh B.Peripheral origin of IL-1β production in the rodent hippocampus under in vivo systemic bacterial lipopolysaccharide（LPS）challenge and its regulation by P2X（7） receptors[J].Journal of Neuroimmunology，2010，219（1）：38-46.

[19] Pertwee RG.Pharmacological actions of cannabinoids[M]//Cannabinoids.Springer Berlin Heidelberg，2005： 1-51.

（收稿日期：2014-01-02）endprint

[8] Gifford AN，Samiian L，Gatley SJ，et al.Examination of the effect of the cannabinoid receptor agonist， CP 55，940，on electrically evoked transmitter release from rat brain slices[J].European Journal of Pharmacology，1997，324（2）：187-192.

[9] Noda M，Doi Y，Liang J，et al.Fractalkine attenuates excito-neurotoxicity via microglial clearance of damaged neurons and antioxidant enzyme heme oxygenase-1 expression[J].Journal of Biological Chemistry，2011，286（3）：2308-2319.

[10] 王均辉，孙峰，于常海，等.异常活化的小胶质细胞的特征与功能[J].生理科学进展，2008，39（1）：37-42.

[11] Perry VH，Nicoll JAR，Holmes C.Microglia in neurodegenerative disease[J].Nature Reviews Neurology，2010，6（4）：193-201.

[12] Takeuchi H，Jin S，Wang J，et al.Tumor necrosis factor-α induces neurotoxicity via glutamate release from hemichannels of activated microglia in an autocrine manner[J].Journal of Biological Chemistry，2006， 281（30）：21362-21368.

[13] Herkenham M，Lynn AB，Little MD，et al.Cannabinoid receptor localization in brain[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，1990，87（5）：1932-1936.

[14] Munro S，Thomas KL，Abu-Shaar M. Molecular characterization of a peripheral receptor for cannabinoids[J].Nature，1993，365：61-65.

[15] Galiègue S，Mary S，Marchand J，et al. Expression of central and peripheral cannabinoid receptors in human immune tissues and leukocyte subpopulations[J].European Journal of Biochemistry，1995，232（1）： 54-61.

[16] Ashton JC，Friberg D，Darlington CL，et al.Expression of the cannabinoid CB2 receptor in the rat cerebellum： an immunohistochemical study[J].Neuroscience Letters，2006，396（2）：113-116.

[17] Howlett AC，Johnson MR， Melvin LS， et al. Nonclassical cannabinoid analgetics inhibit adenylate cyclase： development of a cannabinoid receptor model[J].Molecular Pharmacology，1988，33（3）：297-302.

[18] Cs?lle C，Sperlágh B.Peripheral origin of IL-1β production in the rodent hippocampus under in vivo systemic bacterial lipopolysaccharide（LPS）challenge and its regulation by P2X（7） receptors[J].Journal of Neuroimmunology，2010，219（1）：38-46.

[19] Pertwee RG.Pharmacological actions of cannabinoids[M]//Cannabinoids.Springer Berlin Heidelberg，2005： 1-51.

（收稿日期：2014-01-02）endprint