赵文娟，徐升运（等）

摘要：研究了一株产纺织用中性蛋白酶MYS11菌株的培养基组成。结果表明，该菌株的发酵最适条件为碳源3%玉米粉、氮源1%大豆蛋白粉、添加0.2%KH2PO4。通过正交试验优化了发酵条件，即培养基起始pH 6.8、接种量6%、发酵时间54 h、发酵温度36 ℃。在最适条件下，MYS11菌株产酶活力达到1 884 U/mL，明显高于优化前水平。

关键词：纺织；中性蛋白酶；菌株；发酵条件

中图分类号：Q814.1；TS136 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）07-1641-04

Optimizing the Fermentation Conditions of the MYS11 Strain Producing Neutral Protease for the Textiles

ZHAO Wen-juan1，XU Sheng-yun1，MA Qi2，REN Ping2，QIN Tao1

（1.Institute of Enzyme Engineering，Shaanxi Academy of Sciences， Xian 710600，China；

2.Shaanxi Engineering Center for Enzyme Technology， Xian 710600，China）

Abstract： The fermentation medium of a MYS11 strain producing neutral protease for the textiles were studied. The results showed that the optimal medium was consisted of the carbon source 3% corn powder， the nitrogen source 1% soyabean protein powder， and 0.2% KH2PO4. The fermentation conditions were optimized by the orthogonal experiment. The optimum culture were initial pH 6.8， inoculation volume 6%， the time 54 h and the temperature 36 ℃. Under the optimal conditions， the activity of neutral protease from MYS11 reached 1 884 U/mL， increased obviously than before the optimization.

Key words： textiles； neutral protease； strain； fermentation condition

中性蛋白酶是应用于工业化生产的蛋白酶制剂之一，广泛应用于食品、饲料、纺织、洗涤、皮革脱毛软化、畜禽血液蛋白质水解、果酒啤酒和饮料的澄清以及医学治疗等应用领域中[1-5]。在纺织行业中应用中性蛋白酶进行纺织品整理以及毛织物防毡缩处理，具有广泛的应用前景，已成为研究的热点[6，7]。但是中性蛋白酶的发酵单位一直很低，使用成本高，导致该蛋白酶在纺织上应用受到较大的影响，如何提高中性蛋白酶的发酵单位，成为酶制剂发酵中的难题，其中培养基的组成及发酵条件对中性蛋白酶的产生起着决定性的作用。因此，本研究对产纺织用中性蛋白酶的菌株MYS11的培养基及发酵条件进行优化研究，分析产酶变化，以提高菌株产酶能力。

1 材料与方法

1.1 菌种

MYS11是陕西省科学院酶工程研究所从土壤中分离得到的产纺织用中性蛋白酶菌株。

1.2 主要试剂和仪器

主要试剂：L-Tyrosine（酪氨酸）（Sigma公司）；干酪素（酪蛋白）（上海润捷化学试剂有限公司）；其他药品均为国产分析纯，水为去离子水。

仪器：UV-640型紫外分光光度计、恒温调速摇瓶柜、高速冷冻离心机、水浴锅等。

1.3 培养基

种子培养基（质量分数）：牛肉膏0.5%，蛋白胨0.6%，NaCl 0.5%，pH 7.0。

基础发酵培养基（质量分数）：可溶性淀粉3%，蛋白胨1%，KH2PO4 0.1%，K2HPO4 0.1%，MgCl2 0.1%，pH 7.0。

1.4 酪氨酸标准曲线的制作

分别测定浓度为0、10、20、30、40、50 μg/mL酪氨酸在波长680 nm处的吸光度，根据吸光度值绘制标准曲线[8]。

1.5 中性蛋白酶活力测定

粗酶液的制备：在35 ℃条件下，接种量为5%（V/V），发酵48 h，取发酵液用4层纱布过滤制备粗酶液，用于测定中性蛋白酶的活力。

发酵液酶活力的测定参考文献[8]。1 g固体酶粉（或1 mL液体酶）在一定温度和pH下，1 min 水解酪蛋白产生1 ？滋g酪氨酸，即为一个酶活力单位，以U/mL（U/g）表示。

X=A×k×4/10×n

式中X为样品酶活力，U/mL（U/g）；A为平均吸光度；k为吸光常数；4为反应试剂的总体积（mL）；10为反应时间10 min，以1 min计；n为稀释倍数。

1.6 发酵培养基的选择

对培养基中的碳源、氮源和无机盐进行试验，根据产酶活力的变化确定发酵培养基的组成。①碳源：将基础发酵培养基中的3%可溶性淀粉（对照），分别用相同含量的葡萄糖、果糖、麦芽糖、玉米淀粉、乳糖、玉米粉和麸皮进行替换，其他成分和含量不变，按“1.5”的方法进行发酵培养，测定发酵液中性蛋白酶的活力，以初始发酵培养基的酶活力作为对照，确定最佳碳源；②氮源：以3%玉米粉为碳源，将初始发酵培养基中的1%蛋白胨（对照），分别用相同含量的大豆蛋白粉、牛肉膏、酵母膏、尿素、硝酸铵和豆饼粉替换，其他操作同上，确定最佳氮源；③无机盐：确定发酵培养基的最适碳源、氮源，再将初始培养基中0.1%KH2PO4+0.1%K2HPO4（对照）的无机盐替换为总量是0.2%的KH2PO4、K2HPO4、NaH2PO4、Na2HPO4、KCl、ZnCl2、FeCl2，其他操作同上，选择适宜的无机盐。

1.7 单因素试验

研究培养基起始pH、接种量、发酵时间、培养温度对菌株产中性蛋白酶酶活力的影响。①培养基起始pH。用0.2 mol/L NaOH或HCl将发酵培养基的起始pH分别调为 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，在“1.6”筛选的培养基上进行发酵培养，测定中性蛋白酶酶活力；②接种量。在筛选培养基起始pH的基础上，将种子培养液按 4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%分别进行接种发酵，测定中性蛋白酶酶活力；③发酵时间。在培养基起始pH、接种量筛选的基础上，以12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72 h不同时间段进行发酵，测定中性蛋白酶酶活力；④发酵温度。在前期试验的基础上，在28、30、32、34、36、38、40 ℃的温度下，进行发酵试验，测定中性蛋白酶酶活力。

1.8 发酵条件的优化

以上述单因素试验为基础，以培养基起始pH、发酵时间、发酵温度为因子，进行3因素3水平正交L9（33）试验，每个处理3次重复，优化发酵条件。正交试验因素和水平见表1。

2 结果与分析

2.1 酪氨酸标准曲线

绘制的酪氨酸标准曲线见图1。通过图1的线性相关性可以看出，标准曲线的线性关系良好，计算得到蛋白酶活力公式中的常数k=96.91，在标准要求的95～100之间，因此该标准曲线满足应用的要求，是可行的。

2.2 发酵培养基的选择

2.2.1 最适碳源的确定 从图2可以看出，以玉米粉、果糖为发酵培养基的碳源时，中性蛋白酶酶活力都高于对照可溶性淀粉，以玉米粉为碳源时发酵液中性蛋白酶酶活力最高，达到1 380 U/mL，因此确定发酵培养基的最适碳源为玉米粉。

2.2.2 最适氮源的确定 由图3 可以看出，以大豆蛋白粉、牛肉膏为发酵培养基的氮源时，发酵液中性蛋白酶酶活力都高于对照，其中以大豆蛋白粉为氮源时发酵液酶活力最高，达到1 460 U/mL。因此，确定发酵培养基最适氮源为大豆蛋白粉。

2.2.3 无机盐对产酶的影响 由图4可以看出，当培养基中添加不同的无机盐，对产酶的影响不同，其中添加0.2%的KCl、ZnCl2、FeCl2不利于产酶，而添加0.2% KH2PO4对产酶最有利，因此选择在发酵培养基中添加0.2% KH2PO4。

2.3 发酵条件的优化

2.3.1 培养基起始pH对产酶的影响 由图5可知，当培养基起始pH在5.0～7.0之间时菌株产中性蛋白酶酶活力不断增加；发酵培养基的起始pH大于7.0时，中性蛋白酶酶活力下降，因此培养基起始pH对产酶影响较大。当培养基起始pH在7.0左右时对产酶最为有利，所以确定培养基起始pH为7.0。

2.3.2 接种量对产酶的影响 由图6可知，接种量的不同对菌株产中性蛋白酶也有一定的影响，当接种量在4%～6%时，菌株产中性蛋白酶酶活力随接种量的增加而增大；当接种量大于6%时，菌株产中性蛋白酶酶活力随接种量的增加而减小，因此确定接种量为6%。

2.3.3 发酵时间对产酶的影响 由图7可知，在培养48 h时，菌株产中性蛋白酶酶活力达到峰值，当培养时间超过48 h时，中性蛋白酶酶活力随时间的延长而变化不大。因此，确定发酵时间为48 h。

2.3.4 发酵温度对产酶的影响 由图8可知，当发酵温度小于36 ℃时，菌株产中性蛋白酶酶活力随温度的升高而增加；当温度大于36 ℃时，菌株产中性蛋白酶酶活力随温度的升高而降低。因此，确定发酵温度为36 ℃。

2.3.5 发酵条件的优化 正交试验优化发酵条件的结果见表2。由表2可知，对菌株产中性蛋白酶酶活力影响最大的是发酵时间，其次是培养基起始pH，最后是发酵温度。综合考虑，得出菌株产中性蛋白酶培养基最佳发酵条件为A3B2C1，即发酵时间为54 h、培养基起始pH 6.8、发酵温度36 ℃，得到的发酵液产中性蛋白酶酶活力达1 884 U/mL。

3 小结

通过对产中性蛋白酶的MYS11菌株产酶培养基的碳源、氮源、无机盐进行研究，确定发酵培养基的组成为碳源3%玉米粉、氮源1%大豆蛋白粉、添加0.2%KH2PO4。采用正交试验优化后的发酵条件为培养基起始pH 6.8、接种量为6%、发酵时间为54 h、发酵温度36 ℃。产中性蛋白酶的MYS11菌株在最适发酵条件及培养基组成下，其产酶活性达到1 884 U/mL，与优化前相比有明显的提高，作为原始野生菌株通过诱变筛选，可进一步提高产酶能力，为工业化生产奠定基础，具有良好的开发应用前景。

参考文献：

[1] 李泰明，徐秀兰，李 伟.AS1.398中性蛋白酶固定化条件的初步研究[J].药物生物技术，1998，5（4）：214-218.

[2] 唐 兵，周林峰，陈向东，等.嗜热脂肪芽胞杆菌高温中性蛋白酶的产生条件及酶学性质[J].微生物学报，2000，40（2）：188-192.

[3] 李水泉，姚 恕.中性蛋白酶发酵工艺优化研究[J].微生物学通报，1995，22（3）：150-153.

[4] TAKII Y，URATA Y，UENO N.Themmostable neutral protease resembling thermolysin derived from Bacillus brevis MTB001[J].Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，1998，62（5）：1028-1030.

[5] 肖怀秋，林亲录，李玉珍，等.中性蛋白酶芽孢杆菌BX-4产酶条件及部分酶学性质[J].食品与生物技术学报，2005，24（4）：42-46，56.

[6] 刘延波，姚金波，张耀明，等.用KMnO4/中性蛋白酶法对羊毛进行减量加工的研究[J].毛纺科技，1998（2）：33-37.

[7] 王利平，武志云，闫亦农.WS中性蛋白酶羊毛减量处理[J].毛纺科技，2009（5）：21-24.

[8] QB/T 1803—1993，工业酶制剂通用试验方法[S].

1.7 单因素试验

研究培养基起始pH、接种量、发酵时间、培养温度对菌株产中性蛋白酶酶活力的影响。①培养基起始pH。用0.2 mol/L NaOH或HCl将发酵培养基的起始pH分别调为 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，在“1.6”筛选的培养基上进行发酵培养，测定中性蛋白酶酶活力；②接种量。在筛选培养基起始pH的基础上，将种子培养液按 4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%分别进行接种发酵，测定中性蛋白酶酶活力；③发酵时间。在培养基起始pH、接种量筛选的基础上，以12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72 h不同时间段进行发酵，测定中性蛋白酶酶活力；④发酵温度。在前期试验的基础上，在28、30、32、34、36、38、40 ℃的温度下，进行发酵试验，测定中性蛋白酶酶活力。

1.8 发酵条件的优化

以上述单因素试验为基础，以培养基起始pH、发酵时间、发酵温度为因子，进行3因素3水平正交L9（33）试验，每个处理3次重复，优化发酵条件。正交试验因素和水平见表1。

2 结果与分析

2.1 酪氨酸标准曲线

绘制的酪氨酸标准曲线见图1。通过图1的线性相关性可以看出，标准曲线的线性关系良好，计算得到蛋白酶活力公式中的常数k=96.91，在标准要求的95～100之间，因此该标准曲线满足应用的要求，是可行的。

2.2 发酵培养基的选择

2.2.1 最适碳源的确定 从图2可以看出，以玉米粉、果糖为发酵培养基的碳源时，中性蛋白酶酶活力都高于对照可溶性淀粉，以玉米粉为碳源时发酵液中性蛋白酶酶活力最高，达到1 380 U/mL，因此确定发酵培养基的最适碳源为玉米粉。

2.2.2 最适氮源的确定 由图3 可以看出，以大豆蛋白粉、牛肉膏为发酵培养基的氮源时，发酵液中性蛋白酶酶活力都高于对照，其中以大豆蛋白粉为氮源时发酵液酶活力最高，达到1 460 U/mL。因此，确定发酵培养基最适氮源为大豆蛋白粉。

2.2.3 无机盐对产酶的影响 由图4可以看出，当培养基中添加不同的无机盐，对产酶的影响不同，其中添加0.2%的KCl、ZnCl2、FeCl2不利于产酶，而添加0.2% KH2PO4对产酶最有利，因此选择在发酵培养基中添加0.2% KH2PO4。

2.3 发酵条件的优化

2.3.1 培养基起始pH对产酶的影响 由图5可知，当培养基起始pH在5.0～7.0之间时菌株产中性蛋白酶酶活力不断增加；发酵培养基的起始pH大于7.0时，中性蛋白酶酶活力下降，因此培养基起始pH对产酶影响较大。当培养基起始pH在7.0左右时对产酶最为有利，所以确定培养基起始pH为7.0。

2.3.2 接种量对产酶的影响 由图6可知，接种量的不同对菌株产中性蛋白酶也有一定的影响，当接种量在4%～6%时，菌株产中性蛋白酶酶活力随接种量的增加而增大；当接种量大于6%时，菌株产中性蛋白酶酶活力随接种量的增加而减小，因此确定接种量为6%。

2.3.3 发酵时间对产酶的影响 由图7可知，在培养48 h时，菌株产中性蛋白酶酶活力达到峰值，当培养时间超过48 h时，中性蛋白酶酶活力随时间的延长而变化不大。因此，确定发酵时间为48 h。

2.3.4 发酵温度对产酶的影响 由图8可知，当发酵温度小于36 ℃时，菌株产中性蛋白酶酶活力随温度的升高而增加；当温度大于36 ℃时，菌株产中性蛋白酶酶活力随温度的升高而降低。因此，确定发酵温度为36 ℃。

2.3.5 发酵条件的优化 正交试验优化发酵条件的结果见表2。由表2可知，对菌株产中性蛋白酶酶活力影响最大的是发酵时间，其次是培养基起始pH，最后是发酵温度。综合考虑，得出菌株产中性蛋白酶培养基最佳发酵条件为A3B2C1，即发酵时间为54 h、培养基起始pH 6.8、发酵温度36 ℃，得到的发酵液产中性蛋白酶酶活力达1 884 U/mL。

3 小结

通过对产中性蛋白酶的MYS11菌株产酶培养基的碳源、氮源、无机盐进行研究，确定发酵培养基的组成为碳源3%玉米粉、氮源1%大豆蛋白粉、添加0.2%KH2PO4。采用正交试验优化后的发酵条件为培养基起始pH 6.8、接种量为6%、发酵时间为54 h、发酵温度36 ℃。产中性蛋白酶的MYS11菌株在最适发酵条件及培养基组成下，其产酶活性达到1 884 U/mL，与优化前相比有明显的提高，作为原始野生菌株通过诱变筛选，可进一步提高产酶能力，为工业化生产奠定基础，具有良好的开发应用前景。

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[5] 肖怀秋，林亲录，李玉珍，等.中性蛋白酶芽孢杆菌BX-4产酶条件及部分酶学性质[J].食品与生物技术学报，2005，24（4）：42-46，56.

[6] 刘延波，姚金波，张耀明，等.用KMnO4/中性蛋白酶法对羊毛进行减量加工的研究[J].毛纺科技，1998（2）：33-37.

[7] 王利平，武志云，闫亦农.WS中性蛋白酶羊毛减量处理[J].毛纺科技，2009（5）：21-24.

[8] QB/T 1803—1993，工业酶制剂通用试验方法[S].

1.7 单因素试验

研究培养基起始pH、接种量、发酵时间、培养温度对菌株产中性蛋白酶酶活力的影响。①培养基起始pH。用0.2 mol/L NaOH或HCl将发酵培养基的起始pH分别调为 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，在“1.6”筛选的培养基上进行发酵培养，测定中性蛋白酶酶活力；②接种量。在筛选培养基起始pH的基础上，将种子培养液按 4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%分别进行接种发酵，测定中性蛋白酶酶活力；③发酵时间。在培养基起始pH、接种量筛选的基础上，以12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72 h不同时间段进行发酵，测定中性蛋白酶酶活力；④发酵温度。在前期试验的基础上，在28、30、32、34、36、38、40 ℃的温度下，进行发酵试验，测定中性蛋白酶酶活力。

1.8 发酵条件的优化

以上述单因素试验为基础，以培养基起始pH、发酵时间、发酵温度为因子，进行3因素3水平正交L9（33）试验，每个处理3次重复，优化发酵条件。正交试验因素和水平见表1。

2 结果与分析

2.1 酪氨酸标准曲线

绘制的酪氨酸标准曲线见图1。通过图1的线性相关性可以看出，标准曲线的线性关系良好，计算得到蛋白酶活力公式中的常数k=96.91，在标准要求的95～100之间，因此该标准曲线满足应用的要求，是可行的。

2.2 发酵培养基的选择

2.2.1 最适碳源的确定 从图2可以看出，以玉米粉、果糖为发酵培养基的碳源时，中性蛋白酶酶活力都高于对照可溶性淀粉，以玉米粉为碳源时发酵液中性蛋白酶酶活力最高，达到1 380 U/mL，因此确定发酵培养基的最适碳源为玉米粉。

2.2.2 最适氮源的确定 由图3 可以看出，以大豆蛋白粉、牛肉膏为发酵培养基的氮源时，发酵液中性蛋白酶酶活力都高于对照，其中以大豆蛋白粉为氮源时发酵液酶活力最高，达到1 460 U/mL。因此，确定发酵培养基最适氮源为大豆蛋白粉。

2.2.3 无机盐对产酶的影响 由图4可以看出，当培养基中添加不同的无机盐，对产酶的影响不同，其中添加0.2%的KCl、ZnCl2、FeCl2不利于产酶，而添加0.2% KH2PO4对产酶最有利，因此选择在发酵培养基中添加0.2% KH2PO4。

2.3 发酵条件的优化

2.3.1 培养基起始pH对产酶的影响 由图5可知，当培养基起始pH在5.0～7.0之间时菌株产中性蛋白酶酶活力不断增加；发酵培养基的起始pH大于7.0时，中性蛋白酶酶活力下降，因此培养基起始pH对产酶影响较大。当培养基起始pH在7.0左右时对产酶最为有利，所以确定培养基起始pH为7.0。

2.3.2 接种量对产酶的影响 由图6可知，接种量的不同对菌株产中性蛋白酶也有一定的影响，当接种量在4%～6%时，菌株产中性蛋白酶酶活力随接种量的增加而增大；当接种量大于6%时，菌株产中性蛋白酶酶活力随接种量的增加而减小，因此确定接种量为6%。

2.3.3 发酵时间对产酶的影响 由图7可知，在培养48 h时，菌株产中性蛋白酶酶活力达到峰值，当培养时间超过48 h时，中性蛋白酶酶活力随时间的延长而变化不大。因此，确定发酵时间为48 h。

2.3.4 发酵温度对产酶的影响 由图8可知，当发酵温度小于36 ℃时，菌株产中性蛋白酶酶活力随温度的升高而增加；当温度大于36 ℃时，菌株产中性蛋白酶酶活力随温度的升高而降低。因此，确定发酵温度为36 ℃。

2.3.5 发酵条件的优化 正交试验优化发酵条件的结果见表2。由表2可知，对菌株产中性蛋白酶酶活力影响最大的是发酵时间，其次是培养基起始pH，最后是发酵温度。综合考虑，得出菌株产中性蛋白酶培养基最佳发酵条件为A3B2C1，即发酵时间为54 h、培养基起始pH 6.8、发酵温度36 ℃，得到的发酵液产中性蛋白酶酶活力达1 884 U/mL。

3 小结

通过对产中性蛋白酶的MYS11菌株产酶培养基的碳源、氮源、无机盐进行研究，确定发酵培养基的组成为碳源3%玉米粉、氮源1%大豆蛋白粉、添加0.2%KH2PO4。采用正交试验优化后的发酵条件为培养基起始pH 6.8、接种量为6%、发酵时间为54 h、发酵温度36 ℃。产中性蛋白酶的MYS11菌株在最适发酵条件及培养基组成下，其产酶活性达到1 884 U/mL，与优化前相比有明显的提高，作为原始野生菌株通过诱变筛选，可进一步提高产酶能力，为工业化生产奠定基础，具有良好的开发应用前景。

参考文献：

[1] 李泰明，徐秀兰，李 伟.AS1.398中性蛋白酶固定化条件的初步研究[J].药物生物技术，1998，5（4）：214-218.

[2] 唐 兵，周林峰，陈向东，等.嗜热脂肪芽胞杆菌高温中性蛋白酶的产生条件及酶学性质[J].微生物学报，2000，40（2）：188-192.

[3] 李水泉，姚 恕.中性蛋白酶发酵工艺优化研究[J].微生物学通报，1995，22（3）：150-153.

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[5] 肖怀秋，林亲录，李玉珍，等.中性蛋白酶芽孢杆菌BX-4产酶条件及部分酶学性质[J].食品与生物技术学报，2005，24（4）：42-46，56.

[6] 刘延波，姚金波，张耀明，等.用KMnO4/中性蛋白酶法对羊毛进行减量加工的研究[J].毛纺科技，1998（2）：33-37.

[7] 王利平，武志云，闫亦农.WS中性蛋白酶羊毛减量处理[J].毛纺科技，2009（5）：21-24.

[8] QB/T 1803—1993，工业酶制剂通用试验方法[S].