雍康+张传师（等）

摘要：为了解奶牛S100A12基因序列的特征及其在乳腺和生殖系统中的表达情况，采用RT-PCR技术从奶牛外周血液中扩增S100A12基因，重组到pMD19-T Simple载体中，进行了测序和序列分析，并应用RT-PCR技术检测了奶牛乳腺和生殖系统（卵巢、输卵管、子宫颈、子宫体、阴道等组织）中S100A12 mRNA的表达分布。结果显示，克隆的S100A12基因包含一个279 bp的完整开放阅读框（ORF），与GenBank中的奶牛S100A12基因（NM_174651）编码区序列100%相同，该ORF编码的92个氨基酸含有一个EF手型结构（位于49-84氨基酸残基）；另外，还预测到3个蛋白激酶C磷酸化位点，分别位于19-21、44-46和70-73氨基酸残基。S100A12基因在奶牛乳腺和生殖系统上皮组织中均有表达。推测S100A12基因在奶牛乳腺和生殖系统中具有一定作用。

关键词：S100A12基因；组织表达；基因克隆；奶牛

中图分类号：S858.23 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）07-1616-05

Cloning of Mastitis Resistance-Related Gene S100A12 in Dairy Cow and Its Expression in Lacteal Gland and Genital System

YONG Kang1， ZHANG Chuan-shi1， YANG Qing-wen1，YAO Xue-ping2，CAO Sui-zhong2

（1.Department of Animal Science and Technology，Chongqing Three Gorges Vocational College， Chongqing 404155， China；

2. College of Veterinary Medicine，Sichuan Agricultural University，Yaan 625014，Sichuan，China）

Abstract： To study the characteristics of dairy cow S100A12 gene and its expression in lacteal gland and genital system， the S100A12 gene was amplified by RT-PCR from peripheral blood of dairy cow and sequenced and analyzed after recombination in pMD19-T Simple vector. The expression distributions of S100A12 mRNA in dairy cows lacteal gland and genital system were detected by RT-PCR. The results showed that the cloned S100A12 gene had a 270bp ORF， 100% identical with S100A12 gene in GenBank. In ORF， there was a EF hand formation consisted of 92 amino acids（49-84 amino acids residue）. Three phosphorylation sites of protein kinase C were found in 19-21， 44-46， 70-73 amino acid residues. S100A12 gene was expressed in all epithelial tissue of dairy cow lacteal gland and genital system. It might play an important role in dairy cow lacteal gland and genital system.

Key words： S100A12 gene； tissue expression； gene clone； cow

奶牛乳房炎是影响世界奶牛业发展、给乳品生产造成巨大经济损失的一种常见病和多发病，研究奶牛乳房炎抗性的分子机理，寻找出调控乳房炎抗性的关键或重要的基因及其信号通路，则可以通过营养调控、开发新药治疗和遗传选育等各种策略提高乳房炎抗性，降低乳房炎的发生率[1]。血液白细胞在奶牛乳腺免疫中发挥着关键的作用，乳房炎的发生与乳腺的免疫密切相关，而奶牛乳腺免疫是一个十分复杂的过程，白细胞中大量相关基因以直接或间接的方式参与乳腺免疫[2]，这些因子中就包括S100A12。S100A12是1994年在猪粒细胞中发现的[3]。S100A12蛋白与大多数S100家族蛋白一样，具有较低的相对分子质量和两个EF-手型钙结合结构域[4]，以共价二聚体的形式存在，蛋白由两个EF手型结构组成，EF手型结构又由具有高亲和性和选择性结合于钙离子的螺旋-环-螺旋配基组成，两侧为疏水区，中央为铰链区[5]。N端由14个氨基酸组成，呈环状结构，与钙离子的亲和性低，C端则通常由12个氨基酸组成，并与钙离子具有较高的亲和性[6]。S100A12正常表达于中性粒细胞，同时在淋巴细胞、单核细胞中有低丰度表达[7]。当与钙离子结合后，S100A12蛋白构象发生改变，暴露出与靶蛋白的结合位点，进而通过与相应的靶蛋白作用发挥其生物学效应。因此，S100蛋白被认为是一种钙传感器蛋白，通过钙离子信号传导途径在细胞增殖、分化、肌肉收缩、基因表达、分泌及细胞凋亡中发挥重要作用[8]。S100A12具有上调内皮细胞黏附分子、活化炎性细胞、趋化特性和抗菌活性等功能 [9]。S100A12与RAGE结合后通过NF-kB和MAP激酶信号通路直接引起内皮细胞、单核吞噬细胞和淋巴细胞活化，结果导致促炎细胞因子的合成和分泌[10]，在机体的免疫反应和炎症反应中发挥重要作用。

本研究以奶牛外周血白细胞为材料，应用RT-PCR技术获得了S100A12基因，拟通过分子克隆和生物信息学分析，为深入研究奶牛乳房炎抗性的分子机理提供重要的线索，为基因诊断、抗性育种提供新的资料。并应用RT-PCR技术检测了奶牛乳腺和生殖系统（卵巢、输卵管、子宫颈、子宫体、阴道等组织）中S100A12 mRNA的表达分布，为探索控制奶牛乳房炎抗性的分子遗传机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物及样品采集 成年4～5岁健康奶牛，由四川省雅安市雨城区多营屠宰场提供。屠宰前颈静脉无菌采血10 mL，4 000 r/min常温离心10 min，移液枪小心吸取中间白细胞层置于5 mL RNA store样品保存液中混匀，4 ℃保存。屠宰后，立即采集乳腺、阴道、子宫颈、子宫体、输卵管和卵巢等组织，分别剪成小块，用RNA store 4 ℃浸泡过夜后-20 ℃冷冻保存。患乳房炎奶牛的乳腺组织由四川农业大学传染病实验室自存。

1.1.2 菌株、克隆载体及试剂 克隆宿主菌E.coli DH5α、RNA store样品保存液、RNA simple总RNA抽提试剂盒、质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DNA Marker均为北京天根生化科技有限公司产品；pMDTM19-T Simple Vector、TaKaRa Prime Script RT-PCR Kit、限制性内切酶Hind Ⅲ和BamH I为宝生物工程（大连）有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank中已有的牛S100A12基因序列（NM_174651）以及酶切位点，借助计算机软件Oligo6.0Primer primer 5.0设计了一对引物，上游引物P1：5′-CCGGATCCACTAAGCTGGAAGATCACCTGGAGG-3′；下游引物P2：5′- CCAAGCTTTACTCTTTG TGGATATCTATGTGGGCTG-3′，5′端分别添加BamH I、Hind Ⅲ酶切位点（下划线部分）；由上海英俊生物技术有限公司合成。

1.2.2 中国荷斯坦奶牛外周血总RNA的抽提 取20 mL外周血，按总RNA抽提试剂盒说明书提取各组织总RNA。

1.2.3 RT-PCR反应和cDNA扩增 参照TaKaRa Prime Script RT-PCR Kit说明书操作合成cDNA第一链。RT反应体系包括10 mmol/L dNTP Mixture 1 μL，Oligo dT Primer（2.5 μmol/L）1 μL，总RNA 2.5 μL，RNase Free ddH2O补至10 μL，在PCR仪上进行变性、退火反应（65 ℃ 5 min）。然后在上述Microtube管中配制下列反转录反应液：5×PrimeScriptTM Buffer 4 μL，RNase Inhibitor （40 U/μL） 0.5 μL，PrimeScriptTM RTase（for 2 step） 0.5 μL，RNase Free ddH2O 5 μL，在PCR仪上按42 ℃ 30 min退火延伸，95 ℃ 5 min使反转录酶失活，4 ℃保存，合成cDNA第一链。PCR扩增S100A12基因采用20 μL体系：上述的RT反应液1 μL，dNTP Mixture （10 mmol/L） 10 μL，上、下游PCR引物各1 μL，RNase Free ddH2O 7 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃保持10 min；4 ℃保存。用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

1.2.4 PCR产物与pMD19-T Simple载体的连接 RT-PCR产物经普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化后，与载体连接。按pMD19-T Simple载体试剂盒说明书操作，反应体系10 μL：Solution 5 μL，pMDl9-T Simple载体1 μL，PCR纯化产物3 μL，无菌ddH2O补足至10 μL，混匀后16 ℃连接30 min，连接产物直接转化感受态细胞DH5α。

1.2.5 酶切鉴定及测序 挑取单个白色菌落，接种于5 mL含Amp的LB液体培养基中，37 ℃振摇培养过夜，抽提质粒经BamH I+Hind Ⅲ双酶切，鉴定正确的质粒送上海英骏生物技术有限公司测序，测得序列用DNAStar软件进行序列分析并用Blast进行同源性比较。

1.2.6 S100A12在奶牛乳腺和生殖系统中的表达分析 取冻存的健康奶牛乳腺、卵巢、输卵管、子宫颈、子宫体、阴道和患乳房炎奶牛乳腺组织各100 mg，分别提取总RNA，进行RT-PCR反应，琼脂糖凝胶电泳检测，方法同“1.2.2”与“1.2.3”。

2 结果与分析

2.1 奶牛S100A12基因的克隆及重组质粒的酶切鉴定

RT-PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在287 bp处均出现一条DNA条带，与预期的产物长度吻合（图1A），表明本试验成功地完成了总RNA的抽提与S100A12 cDNA的RT-PCR扩增。阳性克隆质粒经Hind Ⅲ+BamH I双酶切鉴定，获得约2 700 bp（T克隆载体）与287 bp的DNA条带（图1 B）。结果与预期的片段大小相符，证实目的片段已插入T-载体。

2.2 DNA序列分析

将阳性克隆质粒的测序结果用Blast进行同源性比较，与GenBank中的奶牛S100A12基因编码区序列100%相同，包含279 bp（除去内含子）的S100A12基因完整开放阅读框（ORF），推导该序列编码92个氨基酸（图2）。表明克隆所获得的基因片段为预期的奶牛S100A12序列。

奶牛S100A12基因与其他哺乳动物S100基因序列同源性的比较结果（表1）显示，奶牛S100A12基因与猪S100A12基因的同源性最高，为85.7%，其次是猿猴和人，其同源性分别为77.5%、77.2%。对比发现，奶牛S100A12基因除了与奶牛S100A9、S100A4、S100A2基因的同源性较高（同源性分别为61.2%、59.5%、59.2%）以外，与奶牛其他S100基因同源性都不高，其中与奶牛S100A11基因的同源性最低（29.4%）。

奶牛S100A12基因与人及其他哺乳动物S100 cDNA全序列的生物进化树分析结果（图3）显示，奶牛S100A12基因与人、猿猴S100A12基因亲缘关系最近，三者构成亲缘关系相近的一个分支；其次亲缘关系较近的是猪S100A12基因；另外与奶牛S100A8基因的亲缘关系也比较近，构成了一个较小的分支。

利用ExPASy的ProtParam软件分析，相对分子质量为10 575，理论等电点为5.67，利用蛋白质功能位点数据库PROSITE对奶牛S100A12基因编码氨基酸进行结构功能域分析发现，在49-84位氨基酸之间存在一个EF手型结构；另外，还预测到3个蛋白激酶C磷酸化位点，分别位于19-21、44-46和70-73氨基酸残基（图2）。

2.3 S100A12在奶牛乳腺和生殖器官中的表达

从奶牛乳腺和生殖器官（输卵管、卵巢、子宫颈、子宫体、阴道）组织中扩增出了S100A12基因（图4），表明S100A12基因在奶牛的输卵管、卵巢、子宫颈、子宫体、阴道和乳腺中均有表达。

3 讨论

奶牛乳房炎抗性是一个极为复杂的功能。长期以来，虽然对奶牛乳房炎抗性的机理进行了大量研究，但是迄今为止对有关乳房炎抗性的分子机理并不十分清楚，因此进一步筛选和克隆与乳房炎抗性相关的基因并进行基因功能分析对深入了解乳房炎抗性的分子机理具有重要的意义[11]。

Lutzow等[12]通过转录分析牛奶中基因表达的变化，用不同剂量金黄色葡萄球菌感染3头奶牛乳房不同乳区，发现乳腺组织中S100A12基因表达加强，在感染乳区的牛奶中该基因所表达的蛋白质水平显著（P<0.01）提高。Mitterhuemer等[13]将大肠杆菌灌入奶牛乳房后发现，感染乳区和相邻未感染乳区牛奶中S100A12蛋白含量分别比正常牛奶中该蛋白含量高出110倍、4倍。运用蛋白质组学方法，Smolenski等[14]确定了S100钙结合蛋白3个家庭成员（S100A12、S100A11、S100A9）存在于患乳房炎奶牛的牛奶中，但在泌乳高峰期的牛奶或初乳中并没有发现这3种蛋白。据此推测，牛奶中存在的天然免疫蛋白可能决定了乳腺组织的敏感度及抗感染能力。Lippolis等[15]在奶牛嗜中性粒细胞中鉴定出了包括钙结合蛋白S100A12、S100A9在内的250个蛋白，并将S100A12、S100A9归类到具有抗菌活性的免疫蛋白组中。曹随忠[11]利用反向Northern斑点杂交技术对健康奶牛和患乳房炎奶牛外周血液白细胞中差异基因进行了筛选，结果发现，S100A12基因出现的频率最高，据此推测S100A12蛋白可能在奶牛防御乳房炎病原菌感染中发挥重要作用。周雷[16]利用半定量RT-PCR技术检测健康奶牛与患乳房炎奶牛外周白细胞中基因表达情况发现，S100A12等4种基因在奶牛乳房炎时高度表达。充足的证据表明，白细胞在奶牛乳腺免疫中发挥着关键作用，奶牛乳房炎的发生与奶牛乳腺免疫密切相关，研究患乳房炎奶牛与健康奶牛血液白细胞中基因的差异表达可能是鉴定乳房炎抗性相关基因的关键[11]。

本研究中克隆的奶牛S100A12基因编码92个氨基酸，其cDNA序列与人、猪、猿猴和奶牛其他S100基因进化树的分析结果显示，奶牛与人、猪、猿猴S100A12基因亲缘关系比较近，说明S100A12基因的表达具有种属特异性。奶牛、人、猪、猿猴S100A12基因与奶牛S100A8基因之间的关系也较近，形成了1个小的分支。

细胞外S100A12蛋白可以促发多种信号传导途径，包括磷脂酶C（Phospholipase C，PLC）、蛋白激酶C（Protein kinase C，PKC）、钙离子流出、钙调蛋白激酶Ⅱ、丝裂原激活蛋白激酶的激酶（MEK）等途径，人类S100A12的表达需要PKC的激活[17]。在LPS刺激下能激活PKC并能引起S100A12蛋白的分泌[18]。经生物信息学分析预测发现S100A12基因的编码蛋白中含有3个PKC磷酸化位点（图2）。因此，PKC可能在奶牛S100A12 mRNA和蛋白水平上提供基本的开关作用。PKC和蛋白激酶A（PKA）以及Ca2+有助于哺乳动物肝脏、单核细胞和海马神经细胞对C/EBPb mRNA的表达[19]。钙离子作为一种普遍的第二信使在很多细胞信号转导途径中发挥着重要的作用，在细胞内，有许多钙结合蛋白将这种信号再转变成为瞬时信号从而产生一系列的生化反应。这类钙结合蛋白家族都具有一种钙结合区域即EF手型结构（EF-hand），每个EF-hand结构包括含E、F两段螺旋，并形成螺旋-环-螺旋结构[5]。本研究通过生物信息学发现S100A12基因编码的蛋白中含有一个EF手型结构（位于49-84氨基酸残基）。

由于乳腺和生殖系统的特殊生理功能，上皮组织是构成乳腺和整个生殖道防御外界病原微生物的主要屏障，决定了以中性粒细胞为主要组成的先天性免疫防御系统抵御病原微生物入侵的重要地位，而S100A12是中性粒细胞中的关键分子[3]，在发生炎症时显著表达。本试验发现，S100A12在奶牛输卵管、卵巢、子宫颈、子宫体、阴道、乳腺中均有表达。笔者推测S100A12可能通过募集中性粒细胞来扩大炎症反应，这种基因在抵御乳房炎方面起着重要的作用。

不同生理状态下的S100A12基因在乳腺和生殖系统中的表达不同，炎症时表达量显著增高。Buhimschi等[20]运用蛋白质组技术对羊水的研究表明，钙粒蛋白C在内的4个生物分子可用于检测子宫内感染炎症的状态。Wathes等[21]研究证实，奶牛在产后2周内，子宫中S100A12、S100A8、S100A9等抗性基因明显上调。Buhimschi等[22，23]首次通过SELDL-TOF质谱技术证实了S100A12和S100A8在怀孕和未孕妇女子宫颈中的存在，并推测生物标记的S100A8和S100A12是子宫颈阴道分泌物的组成部分，参与机体的防御系统，很可能对上行性感染提供持久保护。杨永新等[24]研究发现钙粒蛋白C类似物在临床型乳房炎奶牛乳腺组织中表达量增加，据此推测，钙粒蛋白C类似物也具有活化吞噬细胞迁移到组织炎症位点的作用。Buitenhuis等[25]对两头奶牛乳腺人工感染大肠杆菌24 h后基因表达分析得知，相对于健康奶牛乳腺组织，其S100A2、S100A8、S100A9和S100A12四种基因重复上调。

在本试验中，S100A12在奶牛乳腺和生殖系统中广泛表达，与其参与乳腺和生殖系统天然免疫防御密切相关，推测其在抵御奶牛乳腺和生殖系统感染中起着至关重要的作用。

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