张永清+吴清平

摘要：采用悬液定量杀菌和流动杀菌的方法，对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、粪链球菌（Streptococcus faecium） 和大肠杆菌（Escherichia coli）的臭氧消毒效果进行了研究。结果表明，悬液定量杀菌试验中，臭氧浓度0.36 mg/L，作用10 min后，铜绿假单胞菌存活率小于1.0 %；臭氧浓度0.31 mg/L，作用3 min后，粪链球菌存活率小于0.1%；臭氧浓度在0.45 mg/L及以上，作用10 min后，大肠杆菌存活率在2.0%以下。流动杀菌试验中，臭氧浓度0.20～0.60 mg/L，作用3 min后，大肠杆菌、铜绿假单胞菌和粪链球菌的存活率在0.01%以下，即杀灭率在99.99%以上。

关键词：臭氧；消毒；铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）；粪链球菌（Streptococcus faecium）；大肠杆菌（Escherichia coli）

中图分类号：TS201.6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）07-1543-03

Killing Effects of Ozone on Pathogens in Mineral Water

ZHANG Yong-qing1，2，3，4，WU Qing-ping1，ZHANG Ju-mei1，GUO Wei-peng1，PENG Fei-ting1，YANG Xiu-hua1

（1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Collection and Application， Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology，

State Key Laboratory of Applied Microbiology （Ministry-Guangdong Province Jointly Breeding Base）， South China， Guangdong Institute of Microbiology， Guangzhou 510070， China； 2. Wuhan Institute of Virology， Chinese Academy of Sciences， Wuhan 430071， China；

3. Graduate University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China；

4. College of Food Science and Engineering， Xuchang University， Xuchang 461000，Henan， China）

Abstract： Both suspension quantitative germicidal test and flow germicidal test were used to study disinfection effects of ozone on the Pseudomonas aeruginosa， Streptococcus faecium and Escherichia coli. The suspension quantitative germicidal test found that the survival rate of Pseudomonas aeruginosa treated with 0.36 mg/L of ozone for 10 min was less than 1.0%， and that of Streptococcus faecium reacted with 0.31 mg/L of ozone for 10 min was less than 0.1%. When the ozone was more than 0.45 mg/L and the time was 10 min， the survival rates of Escherichia coli was under 2.0%. The results of the flow germicidal test showed that the probability of survivability of Escherichia coli， Pseudomonas aeruginosa and Streptococcus faecium treated with 0.20-0.60 mg/L of ozone for 3 min were under 0.01%， with the killing rates of more than 99.99%.

Key words： ozone； disinfection； Pseudomonas aeruginosa； Streptococcus faecium； Escherichia coli

臭氧消毒可迅速杀灭使人和动物致病的各种病菌、病毒等微生物。世界卫生组织对其灭菌功效曾归纳比较，臭氧与其他杀菌剂对大肠杆菌的杀灭效果依次为：臭氧（O3）>次氯酸（HClO）>二氧化氯（ClO2）>银离子（Ag+）>次氯酸根（ClO-）>高铁离子（Fe3+）>三氯胺（NCl3）。因此，臭氧消毒作为氯消毒的替代方法，在水厂中的应用越来越广泛。各厂家为了使微生物指标达标不断加大臭氧投放量，但当原水中有溴离子时，臭氧消毒可以产生消毒副产物溴酸盐。溴酸盐是一种2B级潜在致癌物，具有一定DNA和染色体水平的遗传毒性[1]。因此，利用臭氧消毒时，在微生物达标的情况下还需考虑臭氧消毒副产物溴酸盐的问题。

《饮用天然矿泉水》（GB8537-2008）国标规定，除臭氧外，矿泉水在水处理中不允许添任何物质进行化学消毒和处理，且消毒副产物溴酸盐的限量为10 μg/L。因此，随着中国瓶（桶）装饮用水尤其是矿泉水的迅猛发展，原水含有溴化物的企业必须解决矿泉水中致病菌污染和臭氧消毒副产物溴酸盐问题。调查结果显示，在一些国家和地区饮用水均存在溴酸盐超标问题[2-5]。张永清等[6]对2008年1月至2010年9月《饮用天然矿泉水》国标实施前后矿泉水中铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）及溴酸盐污染情况进行调查发现，2008年1月至2009年9月国标实施前，35份（来自13家企业）水源水和48份（来自20家企业）成品水中铜绿假单胞菌超标率分别为11.43%和35.42%，520份（来自59家企业）矿泉水成品水中溴酸盐超标率为42.12%；2009年10月至2010年9月国标实施后，33份（来自20家企业）水源水和34份（来自27家企业）成品水铜绿假单胞菌超标率分别为30.30%和17.65%，105份（来自46家企业）矿泉水成品水中溴酸盐超标率为18.10%。国标的实施使矿泉水成品水中铜绿假单胞菌和溴酸盐超标现象有所好转，但仍然存在。因此，优化饮用水臭氧工艺，使之达到既能有效杀灭致病菌又能控制消毒副产物溴酸盐超标产生的目的，对于饮用水生产具有重要意义。

本研究针对天然矿泉水中的2种致病菌指标铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和粪链球菌（Streptococcus faecium），采用悬液定量杀菌试验和流动杀菌试验研究了臭氧对二者的杀灭效果，为饮用水生产中致病菌和溴酸盐的有效控制、进行臭氧消毒工艺的优化提供理论基础。同时对大肠杆菌（Escherichia coli）臭氧杀灭效果也进行了一定的研究，为臭氧消毒技术的应用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

试验菌株为大肠杆菌ATCC8099、铜绿假单胞菌ATCC27853和粪链球菌ATCC29212，由广东省微生物研究所微生物检测新技术研究发展中心提供。蠕动泵（兰格YZ1515x型）购自保定兰格恒流泵有限公司；臭氧发生器（OZ-3G型）购自广州市康利科技有限公司；便携式臭氧检测仪（HKM型）购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液的制备 将标准菌株接种新鲜培养基培养24 h，用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释制成菌悬液。

1.2.2 臭氧水的制备 将OZ-3G型臭氧发生器利用空气源氧气产生臭氧，由气体分散器通入超纯水，制备不同浓度的臭氧水。

1.2.3 臭氧浓度的测定 采用国标N，N-二乙基-1，4-苯二胺（DPD）方法（GB11898-89），臭氧与DPD试剂反应，样品溶液呈红色，利用便携式臭氧检测仪进行检测。

1.2.4 中和剂鉴定试验 以大肠杆菌ATCC8099为代表，按《消毒技术规范2002》要求，试验设计6组，以悬液定量杀菌试验程序进行中和剂鉴定。试验结果，第1组无菌落生长或仅有极少数菌落生长；第 2组较第1组多，但较第3、4、5组为较少的菌落生长；第3、4、5组有相似量试验菌落生长，菌悬液浓度在1×107～5×107 CFU/mL，其组间菌落数误差率应不超过15%；第6组无菌落生长，表明所用中和剂及其浓度适宜。

1.2.5 悬液定量杀菌试验 吸取一定浓度的臭氧水4.5 mL于含有0.5 mL菌悬液的无菌试管内，用漩涡混合器混合10 s；静止放置，作用至预定时间；吸取0.5 mL至4.5 mL中和剂试管中混匀，中和作用10 min后取样液0.5 mL进行10倍稀释，选择合适稀释度取0.5 mL接种于平皿中，做活菌培养计数，计算平均存活率。每管接两个平皿。对照组以4.5 mL无菌水代替臭氧水。试验重复3次。

平均存活率=M1/M0×100%

式中，M0为对照组平均活菌量，CFU/mL；M1为试验组平均活菌量，CFU/mL。

1.2.6 流动杀菌试验 用容量大于3 000 mL的烧杯，盛装3 000 mL无菌水样，用移液管滴入制备好的菌悬液，制成含菌量为1×104～2×105 CFU/mL的原溶液进行杀菌试验，并取样作为对照，进行活菌计数。

试验装置如图1所示。含有不同试验菌的原溶液在蠕动泵的作用下流动经过玻璃柱；开启臭氧发生器，开始消毒处理，通过调节蠕动泵流速控制臭氧接触时间。待系统稳定工作10 min后，在取样口取样测定臭氧浓度。另取5 mL溶液作为样品立刻进行微生物测定：吸取0.5 mL样品至4.5 mL中和剂试管中混匀，中和作用10 min；中和后取样液0.5 mL进行10倍稀释，选择合适浓度取0.5 mL接种于平皿中，做活菌培养计数，计算平均存活率。试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 中和剂鉴定试验结果

试验证明（表1），含硫代硫酸钠5 g/L的PBS 溶液组间菌落总数误差为8.58%，小于15%的要求，符合浓度为0.56 mg/L的臭氧中和剂的要求。

2.2 悬液定量杀菌试验结果

对照组平均菌数，大肠杆菌为1.31×106 CFU/mL，铜绿假单胞菌为2.3×105 CFU/mL，粪链球菌为8.5×105 CFU/mL。悬液定量杀菌试验结果（图2-图4）表明，随臭氧浓度的增加和接触时间的延长微生物的存活率降低。当臭氧浓度低于0.30 mg/L，接触时间10 min时，臭氧的杀灭效果从强到弱依次为大肠杆菌、铜绿假单胞菌、粪链球菌，其存活率粪链球菌最大（75.55%）。说明臭氧浓度低于0.30 mg/L时，作用10 min对这3种微生物杀灭效果不好。

接触时间10 min时，臭氧浓度为0.55 mg/L，大肠杆菌存活率在2.00%以下；而臭氧浓度为0.50 mg/L，铜绿假单胞菌和粪链球菌存活率均小于0.10%。对于铜绿假单胞菌，臭氧浓度在0.36 mg/L，接触10 min存活率即小于1.00 %。对于粪链球菌，臭氧浓度在0.31 mg/L，臭氧作用3 min即可使其存活率小于0.10%。

2.3 流动杀菌试验结果

用去离子水作为无菌水样配制的原溶液中，大肠杆菌ATCC8099、铜绿假单胞菌ATCC27853和粪链球菌ATCC29212的对照组平均菌数分别为1.21×104、1.12×104和1.71×105（CFU/mL）。流动杀菌试验结果表明，接触时间为3、5或10 min，去离子水配制原溶液中臭氧浓度在0.20～0.60 mg/L时，臭氧对大肠杆菌、铜绿假单胞菌和粪链球菌的存活率在0.01%以下，即杀灭率均在99.99%以上。

3 小结与讨论

铜绿假单胞菌又称为绿脓杆菌，单生鞭毛，运动活泼，无芽胞，专性需氧的革兰氏阴性杆菌，为条件致病菌。在自然界分布广泛，存在于水、土壤、空气以及人和动物皮肤及肠道中，为食品的主要污染源之一[7]。近年来，饮用天然矿泉水铜绿假单胞菌污染情况日渐受到重视，2009年10月1日开始实施的饮用天然矿泉水新国标中，该菌已被列入新增加的3种致病菌之一（GB8537-2008）。调查发现，矿泉水水源水和成品水均存在铜绿假单胞菌污染现象[6，8]，国标实施后水源水污染为造成成品水污染的主要原因[6]。因此，应加强铜绿假单胞菌的污染控制。铜绿假单胞菌的悬液定量杀菌试验结果显示， 0.50 mg/L浓度臭氧杀灭3 min时，其存活率为0.02%，与粪链球菌效果相似；0.36 mg/L浓度的臭氧杀灭10 min时，铜绿假单胞菌存活率小于1.00%。粪链球菌的悬液定量杀菌试验结果表明，0.31 mg/L浓度的臭氧杀灭3 min即可使其存活率小于0.10%。流动杀菌试验表明，0.20～0.60 mg/L臭氧作用3 min时铜绿假单胞菌的存活率即小于0.01%。结合矿泉水臭氧消毒中溴酸盐的形成研究结果[9]，对于矿泉水中的致病菌铜绿假单胞菌和粪链球菌，消毒过程中控制致病菌和溴酸盐的最佳臭氧浓度为0.3～0.4 mg/L，臭氧接触时间小于5 min。

悬液定量杀菌试验发现，当臭氧浓度在0.30 mg/L以上时，3种菌对臭氧的抗性从大到小依次为大肠杆菌、铜绿假单胞菌和粪链球菌。作用10 min，0.55 mg/L浓度臭氧时，大肠杆菌存活率在2.00%以下，而铜绿假单胞菌和粪链球菌在臭氧浓度0.50 mg/L时存活率均小于0.10%。因此，臭氧应用于大肠杆菌的消毒杀菌时，为了取得较好的杀菌效果，其浓度要高于0.40 mg/L，作用时间要大于5 min。

参考文献：

[1] 王 伟，蒋颂辉，朱惠刚，等.溴酸盐的遗传毒性[J]. 环境与健康杂志，2003，20（3）：137-138.

[2] XIE L， SHANG C. A review on bromate occurrence and removal strategies in water supply [J]. Water Science and Technology，2006，6（6）：131-136.

[3] 孟凡亚.矿泉水及检验培养基国家标准制订的基础研究[D].广州：中国科学院南海海洋研究所，2007.

[4] 岳银玲，李淑敏，应 波，等.超市中瓶装矿泉水溴酸盐含量的调查[J].中国卫生检验杂志，2006，16（6）：677-678.

[5] 张书芳，叶 冰，张 丁，等.瓶装饮用水溴酸盐含量调查[J].现代预防医学，2009，36（11）：2149-2150.

[6] 张永清，吴清平，彭飞艇，等.矿泉水中铜绿假单胞菌及溴酸盐污染情况分析[J].食品与生物技术学报，2012，31（10）：1046-1047.

[7] 闻玉梅. 现代医学微生物学[M].上海：上海医科大学出版社，1999.

[8] 邓梅清，张菊梅，郭伟鹏，等.矿泉水中铜绿假单胞菌污染状况调查研究[J]. 中国卫生检验杂志，2009，19（11）：2672-2673.

[9] 张永清. 包装饮用水臭氧灭菌机理及其消毒副产物溴酸盐控制技术研究[D]. 武汉：中国科学院武汉病毒研究所，2011.

2.3 流动杀菌试验结果

用去离子水作为无菌水样配制的原溶液中，大肠杆菌ATCC8099、铜绿假单胞菌ATCC27853和粪链球菌ATCC29212的对照组平均菌数分别为1.21×104、1.12×104和1.71×105（CFU/mL）。流动杀菌试验结果表明，接触时间为3、5或10 min，去离子水配制原溶液中臭氧浓度在0.20～0.60 mg/L时，臭氧对大肠杆菌、铜绿假单胞菌和粪链球菌的存活率在0.01%以下，即杀灭率均在99.99%以上。

3 小结与讨论

铜绿假单胞菌又称为绿脓杆菌，单生鞭毛，运动活泼，无芽胞，专性需氧的革兰氏阴性杆菌，为条件致病菌。在自然界分布广泛，存在于水、土壤、空气以及人和动物皮肤及肠道中，为食品的主要污染源之一[7]。近年来，饮用天然矿泉水铜绿假单胞菌污染情况日渐受到重视，2009年10月1日开始实施的饮用天然矿泉水新国标中，该菌已被列入新增加的3种致病菌之一（GB8537-2008）。调查发现，矿泉水水源水和成品水均存在铜绿假单胞菌污染现象[6，8]，国标实施后水源水污染为造成成品水污染的主要原因[6]。因此，应加强铜绿假单胞菌的污染控制。铜绿假单胞菌的悬液定量杀菌试验结果显示， 0.50 mg/L浓度臭氧杀灭3 min时，其存活率为0.02%，与粪链球菌效果相似；0.36 mg/L浓度的臭氧杀灭10 min时，铜绿假单胞菌存活率小于1.00%。粪链球菌的悬液定量杀菌试验结果表明，0.31 mg/L浓度的臭氧杀灭3 min即可使其存活率小于0.10%。流动杀菌试验表明，0.20～0.60 mg/L臭氧作用3 min时铜绿假单胞菌的存活率即小于0.01%。结合矿泉水臭氧消毒中溴酸盐的形成研究结果[9]，对于矿泉水中的致病菌铜绿假单胞菌和粪链球菌，消毒过程中控制致病菌和溴酸盐的最佳臭氧浓度为0.3～0.4 mg/L，臭氧接触时间小于5 min。

悬液定量杀菌试验发现，当臭氧浓度在0.30 mg/L以上时，3种菌对臭氧的抗性从大到小依次为大肠杆菌、铜绿假单胞菌和粪链球菌。作用10 min，0.55 mg/L浓度臭氧时，大肠杆菌存活率在2.00%以下，而铜绿假单胞菌和粪链球菌在臭氧浓度0.50 mg/L时存活率均小于0.10%。因此，臭氧应用于大肠杆菌的消毒杀菌时，为了取得较好的杀菌效果，其浓度要高于0.40 mg/L，作用时间要大于5 min。

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[9] 张永清. 包装饮用水臭氧灭菌机理及其消毒副产物溴酸盐控制技术研究[D]. 武汉：中国科学院武汉病毒研究所，2011.

2.3 流动杀菌试验结果

用去离子水作为无菌水样配制的原溶液中，大肠杆菌ATCC8099、铜绿假单胞菌ATCC27853和粪链球菌ATCC29212的对照组平均菌数分别为1.21×104、1.12×104和1.71×105（CFU/mL）。流动杀菌试验结果表明，接触时间为3、5或10 min，去离子水配制原溶液中臭氧浓度在0.20～0.60 mg/L时，臭氧对大肠杆菌、铜绿假单胞菌和粪链球菌的存活率在0.01%以下，即杀灭率均在99.99%以上。

3 小结与讨论

铜绿假单胞菌又称为绿脓杆菌，单生鞭毛，运动活泼，无芽胞，专性需氧的革兰氏阴性杆菌，为条件致病菌。在自然界分布广泛，存在于水、土壤、空气以及人和动物皮肤及肠道中，为食品的主要污染源之一[7]。近年来，饮用天然矿泉水铜绿假单胞菌污染情况日渐受到重视，2009年10月1日开始实施的饮用天然矿泉水新国标中，该菌已被列入新增加的3种致病菌之一（GB8537-2008）。调查发现，矿泉水水源水和成品水均存在铜绿假单胞菌污染现象[6，8]，国标实施后水源水污染为造成成品水污染的主要原因[6]。因此，应加强铜绿假单胞菌的污染控制。铜绿假单胞菌的悬液定量杀菌试验结果显示， 0.50 mg/L浓度臭氧杀灭3 min时，其存活率为0.02%，与粪链球菌效果相似；0.36 mg/L浓度的臭氧杀灭10 min时，铜绿假单胞菌存活率小于1.00%。粪链球菌的悬液定量杀菌试验结果表明，0.31 mg/L浓度的臭氧杀灭3 min即可使其存活率小于0.10%。流动杀菌试验表明，0.20～0.60 mg/L臭氧作用3 min时铜绿假单胞菌的存活率即小于0.01%。结合矿泉水臭氧消毒中溴酸盐的形成研究结果[9]，对于矿泉水中的致病菌铜绿假单胞菌和粪链球菌，消毒过程中控制致病菌和溴酸盐的最佳臭氧浓度为0.3～0.4 mg/L，臭氧接触时间小于5 min。

悬液定量杀菌试验发现，当臭氧浓度在0.30 mg/L以上时，3种菌对臭氧的抗性从大到小依次为大肠杆菌、铜绿假单胞菌和粪链球菌。作用10 min，0.55 mg/L浓度臭氧时，大肠杆菌存活率在2.00%以下，而铜绿假单胞菌和粪链球菌在臭氧浓度0.50 mg/L时存活率均小于0.10%。因此，臭氧应用于大肠杆菌的消毒杀菌时，为了取得较好的杀菌效果，其浓度要高于0.40 mg/L，作用时间要大于5 min。

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[5] 张书芳，叶 冰，张 丁，等.瓶装饮用水溴酸盐含量调查[J].现代预防医学，2009，36（11）：2149-2150.

[6] 张永清，吴清平，彭飞艇，等.矿泉水中铜绿假单胞菌及溴酸盐污染情况分析[J].食品与生物技术学报，2012，31（10）：1046-1047.

[7] 闻玉梅. 现代医学微生物学[M].上海：上海医科大学出版社，1999.

[8] 邓梅清，张菊梅，郭伟鹏，等.矿泉水中铜绿假单胞菌污染状况调查研究[J]. 中国卫生检验杂志，2009，19（11）：2672-2673.

[9] 张永清. 包装饮用水臭氧灭菌机理及其消毒副产物溴酸盐控制技术研究[D]. 武汉：中国科学院武汉病毒研究所，2011.