钱卫东， 宁肖肖， 王 兰， 蔡长龙， 毛培宏， 李梦媛

(1.陕西科技大学 生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021； 2.西安工业大学 光电工程学院， 陕西 西安 710021； 3.新疆大学 物理科学与技术学院， 新疆 乌鲁木齐 830046 )

0 引言

D-阿拉伯糖醇是一种五碳糖醇，分子式为C5H12O5，分子量为152.12，是木糖醇和核糖醇的同分异构体.糖醇是经糖还原的一类多元醇，具有低热值、抗龋齿、不影响胰岛素水平[1]等优点，在医药、食品、化工等领域具有重要的应用价值.

目前，常规生产D-阿拉伯糖醇的方法主要是化学法合成[2].但是该方法反应过程复杂、设备要求高、环境污染严重.针对化学合成法的缺点，人们将目光集中于通过生物转化法生产D-阿拉伯糖醇，因其反应条件温和、生产工艺简单而备受关注.

Spencer等[3]研究发现耐高渗酵母在高渗条件下可产生多元醇，代谢葡萄糖产生的多元醇主要有甘油、D-阿拉伯糖醇、赤醉糖醇等，其中五碳多元醇以D-阿拉伯糖醇为主[4].但是大部分产D-阿拉伯糖醇的酵母菌株对底物葡萄糖的转化率较低,并且普遍存在甘油及其它多元醇副产物.

乳酸克鲁维酵母具有营养要求极其简单、生物量大、生长温度适应范围广、分泌蛋白能力强、不产生内毒素[5,6]、生长旺盛等优点.因此,长期以来一直被用于发酵工业.

低能离子N+注入技术作为一种新的诱变源，目前在国内微生物育种方面已取得显著成效[7,8].低能离子注入生物体时,同时存在能量交换、能量沉积、质量沉积及电荷交换等四大效应.注入离子的电荷数、质量数、能量和剂量的组合不同，可以提供较多的诱变条件，使离子注入诱变具有突变谱宽、突变率高等特点，从而可以筛选到符合生产要求、提高产量的突变体[9-11].然而,低能N+离子注入技术转化的随机性较大，因此建立一种高通量的快速高通量筛选方法尤为重要.

1 材料与方法

1.1 菌株和培养基

1.1.1 菌株

乳酸克鲁维酵母(KluyveromyceslactisATCC12426),购自中国工业微生物菌种保藏管理中心.

1.1.2 培养基

(1)斜面培养基(g/L): 葡萄糖20，酵母膏10，蛋白胨20，琼脂20，121 ℃灭菌 20 min.

(2)种子培养基(g/L): 葡萄糖20， 酵母膏 10，蛋白胨 20，121 ℃灭菌 20 min.

(3)发酵培养基(g/L): 葡萄糖200，酵母膏10，蛋白胨20，硫酸铵3，七水硫酸镁0.2，121 ℃灭菌20 min.

1.2 低能N+离子注入

1.2.1 菌悬液的制备

将本实验室保藏的出发菌株(KluyveromyceslactisATCC12426)于斜面培养基上划线，置于37 ℃恒温培养24 h后，挑取单菌落接种到YPD液体培养基中，于37 ℃、160 r/min振荡培养18 h得到菌液.

1.2.2 菌膜制备

用无菌水将菌液稀释至1.0×107CFU/mL，取100μL菌体稀释液均匀涂布于无菌平皿中央，用无菌风吹干制成菌膜.

1.2.3 离子注入

将菌膜置于离子注入机的无菌靶台上，用能量为25 keV，不同剂量的离子束在10-3Pa真空状态下以10 s脉冲方式，进行离子注入.

1.2.4 重组菌株的预培养

经过步骤1.2.3后，用2 mL YPD液体培养基浸泡菌膜，37 ℃温育2 h，用无菌玻璃刮铲洗脱平皿上的菌膜，获得洗脱液；未注入的对照菌膜也作同样处理.用移液枪将洗脱液转移至装有5 mL液体培养基的试管中，于37 ℃、160 r/min振荡培养24 h.

1.3 高产菌株的初筛

D-阿拉伯糖醇高产菌株有耐高渗的特性，因此可以用高糖培养基进行初筛.

1.3.1 高糖培养基组分的确定

按照1.2.1制备出发菌株的菌悬液，吸取100μL菌悬液均匀涂布于葡萄糖浓度分别为30%、40%、50%、60%的固体培养基上.将培养基置于37 ℃恒温培养48 h,观察菌体的生长情况.

1.3.2 高糖培养基初筛

将1.2.4所得重组菌株的菌液涂布于高糖固体培养基上，于37 ℃恒温培养48 h，观察菌体生长情况.

1.4 高产菌株的复筛

D-阿拉伯糖醇产生菌株的复筛,采用纸色谱和高效液相色谱连用的方法.纸色谱具有设备简单、操作方便、所需样品少且灵敏度较高等优点，其对于大量菌体的筛选实验非常适合[12].

高效液相色谱[13]具有较高的准确性、速度快、分辨率高、灵敏度高等优点，适合对纸色谱法筛选结果进行验证实验.高效液相色谱的色谱条件为色谱柱：SH1011；流动相：0.01 mol/LH2SO4；流速：0.8 mL/min；进样量：5μL；柱温：50 ℃；检测器：示差检测器(RID).

1.4.1 标准溶液的配制

精密称取D-阿拉伯糖醇、甘油、葡萄糖等各0.100 0 g，分别装于10 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，配成单组分质量浓度为1%的标准溶液.取2 mL的四种溶液混合均匀，即成混合标样.

1.4.2 样品的处理

从高糖筛选培养基上挑取生长情况较好的单菌落接入种子培养基中，37 ℃、160 r/min振荡培养24 h得种子液.将种子液按5%的接种量接种至发酵培养基中，置于37 ℃，160 r/min 连续发酵培养120 h得发酵液.取80 mL发酵液于100 mL离心管中，12 000 r/ min离心5 min，将上清液80 ℃浓缩至10 mL得到样品.

1.5 重组菌株的遗传稳定性试验

将1.4筛选出来的高产菌株以2%的接种量接入液体培养基中，于37 ℃、160 r/min传代培养8代，测定每代菌株发酵液中D-阿拉伯糖醇的产量.若每代菌株发酵液中D-阿拉伯糖醇的产量变化不大，则说明该菌株遗传稳定性高.

2 结果与讨论

2.1 离子注入剂量的选择

不同微生物细胞对诱变剂的敏感程度不同，只有在合适的剂量下才能获得理想的诱变效果.本研究首先考察了不同注入剂量对乳酸克鲁维酵母的影响.做出“马鞍型”曲线，如图1所示，存活率呈先下降再上升后下降的趋势.

研究表明，当以能量为25 keV、剂量低于2.0×1015ion/cm2离子注入Kluyveromyceslactis时，注入N+只对细胞表面造成损伤和刻蚀，存活率下降；随着注入剂量的增加，细胞表面刻蚀严重，存活率急剧下降；当注入剂量达到4.0×1015ion/cm2时，存活率下降到19%；随着注入剂量继续增加，可以激活细胞自身某种修复机制，存活率出现微幅回升；当剂量继续上升超过6.0×1015ion/cm2时，对细胞的破坏已经严重超出了细胞本身的修复能力，细胞死亡，存活率急剧下降.所以，离子注入的最佳能量为25keV，剂量为6.0×1015ion/cm2.

图1 氮离子注入乳酸克鲁维酵母 的存活率曲线

2.2 高产菌株的初筛

2.2.1 高糖培养基组分的确定

观察原始出发菌株在葡萄糖浓度分别为30%、40%、50%、60%的固体培养基上的生长情况如图2所示.由图2可知，随着葡萄糖浓度的增加，原始出发菌株的生长情况变弱.当葡萄糖浓度为50%时，原始出发菌株已经不能正常生长.因此，确定高糖筛选培养基葡萄糖浓度为50%.

图2 高糖培养基菌体生长情况

2.2.2 高糖培养基初筛结果

将1.2.4所得重组菌株的菌液涂布于葡萄糖浓度为50%的高糖固体培养基上，于37 ℃恒温培养48 h后，挑取生长情况较好的菌落，用高糖培养基保藏菌种，以备复筛.

2.3 高产菌株复筛结果分析

2.3.1 纸色谱法展开体系的优化

(1)展开剂的优化

根据底物与产物均为羟基类物质及物质的相似相容性，对展开剂正丁醇：吡啶：水进行不同配比组合的优化，对混合标品进行层析，结果见表 1所示.

由表1中结果可知，随着分子量的增大，迁移率逐渐减小，D-阿拉伯糖醇的迁移率较大，葡萄糖的迁移率较小.根据 Rf值和分离度，选用了11号层析剂，即,正丁醇∶吡啶∶水=14∶3∶3.

表1 混合层析的Rf值

(2)点样量的优化

本研究对点样量进行考察，通过比较点样量为0.5μL，1.0μL，1.5μL，2.0μL的情况,发现点样量为1.5μL时分离效果较好;当点样量为2.0μL时，拖尾严重，很难将葡萄糖和D-阿拉伯糖醇分开;当点样量为0.5μL和1.0μL时，显色斑点不清晰.

(3)显色剂的优化

常用的糖醇显色剂主要是饱和硝酸银丙酮溶液(A)-氢氧化钠酒精溶液(B).显色原理[14]是羟基与硝酸银的硝酸根离子发生螯合作用将硝酸银固定，喷上氢氧化钠后，硝酸银与氢氧化钠会立即形成棕黑色的氧化银，还原糖和糖醇在室温下就能形成黑色显色点.当还原结束时，将滤纸浸泡在氨水中，溶解过量的氧化银，然后用自来水冲洗，干燥后就能得到棕黑色的斑点.

本研究对A中的硝酸银和B中的氢氧化钠浓度进行了优化.发现将饱和硝酸银和饱和氢氧化钠优化成50%时，显色结果比没有优化前更加明显，不需要用氨水退色也可以显示出清晰的斑点，优化结果见图3所示.分析其原因，主要考虑两点:其一,硝酸银浓度应该与目标产物浓度相当;其二，硝酸银浓度过大时，会使滤纸整体显色太深，需要用氨水溶解多余的硝酸银.

1：D-阿拉伯糖醇;2:D-阿拉伯糖醇和葡萄糖两者的混合；3：葡萄糖图3 展开体系优化前后标品的纸层析图

2.3.2 纸色谱法复筛结果

将1.4得到的标品和样品按照2.3.1优化后的展开体系进行纸色谱分析，得到5株显色斑点较大的菌株.

2.4 高效液相法复筛

将2.3.2得到的显色斑点较大的5株菌株的发酵液浓缩后，用微孔滤膜过滤，采用高效液相色谱法对其进行验证.试验结果表明，显色较大的斑点所对应的发酵液中D-阿拉伯糖醇含量较高，最高可达88.23 g/L.

2.5 重组菌株的遗传稳定性试验结果分析

将2.4筛选得到的高产菌株传代培养8代，测定每代发酵液中D-阿拉伯糖醇的产量，其结果见图4所示.D-阿拉伯糖醇的产量略有波动，但变化不显著，说明该菌株遗传稳定性高.

图4 高产菌株的传代稳定性试验

3 结论

本研究利用低能N+离子注入技术对乳酸克鲁维酵母进行诱变，构建了D-阿拉伯糖醇高产工程菌，通过做出马鞍形曲线确定了离子注入的最佳剂量和能量组合.根据高产菌株具有耐高渗的性质，建立了用高糖培养基进行初筛的方法，再将纸色谱法与高效液相色谱法联合使用进行复筛.根据纸层析显色斑点的大小筛选得到了较高产菌株，用高效液相色谱法对纸色谱法的筛选结果进行了验证.

试验结果表明，本研究建立的高糖培养基初筛，以及纸色谱法与高效液相色谱法连用复筛的筛选方法专属性强，操作方便，可以快速地从大批量诱变菌株中筛选出高产菌株.

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