秦俊哲， 任金玫， 殷 红

0 引言

桑黄(Phellinuslinteus),担子菌亚门多孔菌科针层孔菌属真菌，是一种珍贵的药用真菌[1]，最早记载于李时珍《本草纲目》，而桑黄多糖为桑黄的

主要功效成分[2]，其药理作用主要有抗癌、增强免疫力[3]、抗纤维化[4]、降血糖[5]等.目前有很多关于桑黄多糖的提取工艺的研究报道，但有关微波辅助提取桑黄子实体多糖的工艺研究，鲜有报道.微波辅助提取技术是近年来新发展起来的一种方法，相比于传统的提取方法，具有提取效率高、选择性高等优点[6]，现已成功应用于天然植物活性成分的提取[7].本实验将微波辅助提取法应用桑黄子实体多糖的提取工艺研究，采用响应曲面法(Response Surface Methodology)对微波辅助提取桑黄多糖的工艺进行初步探索并优化，为桑黄子实体多糖的提取提供一定的参考.

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 原料

桑黄子实体，陕西科技大学微生物实验室人工培育.

1.1.2 主要试剂

葡萄糖、苯酚、DNS试剂、浓硫酸、无水乙醇、95%乙醇、丙酮和乙醚，均为分析纯.

1.1.3 主要仪器

WD900(MG-5562S)格兰仕微波炉；TGL-16M高速台式冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；756PC紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；旋转蒸发仪，上海荣生有限公司；电热鼓风干燥箱，北京科伟永兴仪器有限公司.

1.2 方法

1.2.1 桑黄多糖的提取工艺流程

桑黄子实体→粉碎→80%乙醇回流→烘干滤渣→粉碎→过筛→微波提取→抽滤→浓缩→4倍体积醇沉→离心→洗涤→定容→粗多糖溶液.

1.2.2 多糖含量的测定与计算

采用苯酚-硫酸法测定水溶性总糖质量,采用DNS法测定还原糖质量[8].

多糖质量及其得率的计算公式如下[9]：

多糖质量(g)=总糖质量(g)-还原糖质量(g)

多糖得率(%)=[多糖质量(g)/原料质量(g)]×100%

1.2.3 单因素实验

影响桑黄多糖得率的因素有很多，现通过单因素实验选取实验因素与水平.

1.2.4 微波辅助提取桑黄多糖的工艺优化

根据Box-Benhnken的中心组合实验设计原理[10]，在单因素实验的基础上，选取对微波辅助提取桑黄多糖较显著的因素，即提取时间、微波功率、料液比，分别用A、B、C表示，实验设计如表1所示.

表1 Box-Behnken因子水平编码表

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 料液比对桑黄多糖得率的影响

称取4份桑黄粉末各1 g，选定料液比分别为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，在微波功率为540 W的条件下提取5 min，结果如图1所示.

图1 料液比对多糖得率的影响

由图1可知，多糖得率随着料液比的增加而增大，但增加到1∶40时趋于平稳，因此选择料液比为1∶40左右较适宜.

2.1.2 提取时间对桑黄多糖得率的影响

固定料液比为1∶40，在微波功率为540 W的条件下，考察不同提取时间对多糖得率的影响，结果如图2所示.

图2 提取时间对多糖得率的影响

由图2可知，随着提取时间的延长，多糖得率不断增加.4 min之前增加较为明显，5 min之后有下降趋势.可能是因为时间过长，会破坏部分多糖的结构，因此选择提取时间为5 min左右.

2.1.3 微波功率对桑黄多糖得率的影响

固定料液比为1∶40，在微波功率180 W、360 W、540 W、720 W条件下处理5 min，结果如图3所示.

图3 微波功率对多糖得率的影响

从图3中看出，多糖得率随微波功率的增大而呈先升后降趋势，微波功率540 W时多糖的含量达到最大，功率720 W时多糖含量有降低的趋势；这可能是因为功率偏低时浸提不完全，而功率过大时会破坏多糖的结构，故选取微波功率540 W左右较适宜.

2.1.4 提取次数对桑黄多糖得率的影响

固定料液比为1∶40，在微波功率为540 W时提取5 min，比较不同提取次数对桑黄多糖得率的影响，结果如图4所示.

图4 提取次数对多糖得率的影响

由图4知，浸提第2次比第1次的多糖得率增加显著，而浸提3次多糖得率增加很少，从经济角度考虑，选择2次提取为宜.

2.2 响应面实验结果与分析

2.2.1 实验设计

以桑黄多糖得率为响应值(y)，分别以-1、0、1代表自变量的低、中、高水平，设计3因素3水平实验，其中1-12是析因实验，13-17是中心实验，实验方案及结果如表2所示.

表2 响应面法设计与实验结果

2.2.2 模型的建立与显著性检验

利用Design-Expert 8.0软件对实验结果进行回归拟合，得到桑黄多糖得率对以上3个变量的二次多项回归方程：

Y=4.24+0.016A+0.093B+0.021

C-0.093AB-0.15AC-0.048BC-

0.17A2-0.35B2-0.15C2

回归模型方差分析如表3所示.

表3 回归模型方差分析表

表4 回归方程系数显著性分析

注：“***” 差异极显著(p<0.001)；“**”差异高度显著(p<0.01).

由表4知，微波功率的一次项达到高度显著水平(P<0.01)，对多糖产率的影响最大，其次是提取时间与料液比.另外，提取时间与微波功率的交互作用达到高度显著水平，时间与料液比的交互作用差异极显著；考察二次项可知，微波功率二次项>时间二次项>料液比二次项，且均达到极显著水平.

2.2.3 响应面分析

图5 Y=f(A，B)的响应面与等高线图

图6 Y=f(A，C)的响应面与等高线图

借助Design Expert 8.0软件，根据回归模型作出相应的响应曲面和等高线图.从等高线中可以直观判断两因素交互作用情况，圆形表示二因交互作用不显著，椭圆表示二因素交互作用显著[11].本实验中3个因素之间交互作用对多糖得率的影响如图5和图6所示.从这两组图的响应面最高点和等高线可以看出，在所选范围内存在极值.由图5可以得知，液料比为40∶1时，随着提取时间在4.5～5.5 min之间变化，多糖得率增加并不明显，当微波功率从360 W增加到720 W时，多糖得率呈先增大后降低的趋势，因此适当提高微波功率可以提高多糖得率.

从图6可以看出，当微波功率为540 W时，随着时间和料液比的增大，桑黄多糖的得率达到最大值，当时间和料液比继续增大时，多糖得率降低.

2.2.4 提取工艺条件的确定

通过回归模型的数学分析可知，微波辅助提取桑黄多糖的最佳工艺参数为：提取时间5.1 min，微波功率558 W，料液比为1∶41，在此工艺条件下，桑黄多糖得率的理论值为4.241%.为检验响应面法优化微波辅助提取桑黄多糖工艺的可靠性，采用已优化到的提取条件进行验证实验，由于实际操作条件有限，将工艺参数调整为：提取时间5.1 min，微波功率540 W，料液比1∶41，提取2次，实验重复3次，测得多糖得率为4.18%，与理论预测值相比，相对误差在1.4%左右.

因此，基于响应面法优化得到的微波辅助提取工艺参数，准确可靠.

3 结论

本实验通过响应曲面法优化微波辅助提取桑黄多糖的工艺条件，并确定最佳的提取工艺参数为：提取时间5.1 min，微波功率540 W，料液比1∶41，提取次数为2次，在此条件下，多糖得率可达4.18%.

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