高连祥 胡炎坤 王 莹 贾海燕 李 霞 任 睿

35例恶性肿瘤患者淋巴细胞Ag-NORs检测分析

高连祥 胡炎坤 王 莹 贾海燕 李 霞 任 睿

目的细胞核仁形成区（NORs）由核糖体RNA基因组成，位于此区调控rRNA转录的酸性非组蛋白可被硝酸银染色（Ag-NOR），肿瘤细胞中Ag-NOR数目、分布和强度可作为肿瘤诊断、细胞分型和分化分级的重要指标。由于肿瘤细胞相关分子等的毒性作用，患者淋巴细胞NORs区的酸性非组蛋白得以表达。有别于非恶性疾病，并以此进行肿瘤诊断和病情监测。方法北京健尔康医疗设备有限公司提供的KL型肿瘤免疫图像分析系统，5%硝酸银及相应的银染试剂，RPMI1640培养液，普通细胞银染技术对患者外周血淋巴细胞染色。选择35例恶性肿瘤患者及35例健康对照者，经培养、制片、银染、图像分析四个步骤，计算T淋巴细胞核银染面积与细胞面积比值（即 I.S%值）。结果对70例正常者和各种肿瘤患者的淋巴细胞酸性非组蛋白表达活性进行了对比研究，发现恶性疾病与正常者之间有明显差异。35例肿瘤患者中有28例阳性结果，有统计学意义，说明I.S%阳性结果与肿瘤有较密切联系，但并无特异性，这与有关文献报道相符。结论外周血T淋巴细胞Ag-NORs检测，可作为恶性肿瘤诊断及病情监测的重要参考指标。

KL型图象分析系统；T淋巴细胞Ag-NORs检测；肿瘤

利用免疫学方法对恶性肿瘤患者进行诊断、治疗和预后的监测近年来受到广泛重视，也是临床肿瘤学进展的重要领域之一，T淋巴细胞是机体参与抗肿瘤作用的主要免疫细胞，国内外对T淋巴细胞核仁形成区酸性非组蛋白（Ag-NOR）表达，研究了Ag-NOR与癌症的种种关系。我院2003年3月～2004年 7月对 35例正常者和 35例癌症患者的Ag-NOR进行观察并报告其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料正常者35例为对照组；住院的肿瘤患者35例作为研究组，具体见表1。

1.2 设备及试剂设备使用北京健尔康医疗设备有限公司生产的KL型肿瘤免疫图像分析系统；试剂由健尔康医疗设备有限公司提供的 RPMI-1640培养基、低渗液、银染液（5%硝酸银）固定液等配套试剂。

表1 两组临床资料比较(n)

1.3 方法①在无菌条件下取0.5ml抗凝血加到含PHA的RPMIl640培养液的瓶中，放置在37℃培养箱内，培养至 72h；②制片是将培养的细胞悬液轻轻混匀并吸到5m1离心管中，2000rpm离心5min，弃去上清液后加入 5ml低渗液，充分混匀，加入0.5ml固定液，混匀，离心弃上清液，再加入 5m1固定液并混匀，弃上清液，上述步骤再重复一次，沉淀中加0.3ml固定液，混匀后取2～3滴滴到预冷的玻璃片上，晾干；③银染处理将水浴箱温度升到80～90℃，上面放置铝板，铝板热后放置滴有细胞的载坡片，热后加染液A4滴，染液B2滴，取盖玻片轻轻放在样品玻片上，待涂片变成深黄色时取下，约4min再用净水冲洗干净，自然晾干。

1.4 图像分析将染片置显微镜载物台上，启动图像分析程序，计算30个T淋巴细胞核仁银染面积与细胞核银染面积比值（I.S%），见图1、图2。

图1 健康体检T淋巴细胞I.S%值

图2 多发性骨髓瘤T淋巴细胞I.S%值

2 结果

35例正常者I.S%值平均为7.2%，35例肿瘤患者中肝癌6例I.S%值平均为4.50%，肺癌7例I.S%值平均为4.98%，胃肠癌7例I.S%值4.87%，10例其它转移癌I.S%值平均为4.78%，5例存活5年以上无转移者 I.S%值平均为 6.67%。恶性肿瘤患者总的 I.S%值平均为 4.84%。正常者与恶性肿瘤统计P＜0.05，见表2。不同部位的恶性肿瘤的I.S%值无明显差异（P＞0.05），见表3。

表2 正常者与恶性肿瘤患者T淋巴细胞Ag-NORs检测结果

表3 不同肿瘤患者T淋巴细胞Ag-NORs检测结果

3 讨论

细胞核仁形成区（NORs）是细胞周期一定时期细胞核中出现环型卷曲的DNA，主要由 rDNA组成。Ag-NOR为被硝酸银染色的NORs区，肿瘤患者免疫活性细胞中，调控rRNA合成的酸性非组蛋白的表达受到相对特异性抑制，这种抑制在途径和程序上有别于其它非癌性因素对免疫系统的抑制；T淋巴细胞是机体参与抗肿瘤免疫应答的主要免疫活性细胞。因此，通过监测患者T淋巴细胞核仁形成区酸性非组蛋白表达，可以较敏感地反映出患者癌症的存在和病情状态，有利于肿瘤的诊断和病情监测[1-2]。本研究利用KL型图象分析系统，分析肿瘤患者外周血T淋巴细胞核仁区酸性非组蛋白转录活性，研究其在肿瘤诊断、鉴别诊断和病情监测中的意义。

对正常者及恶性肿瘤患者的检测结果表明，肿瘤患者非组蛋白的表达明显降低，经统计学分析，有显著性差异（P＜0.05）。表3中不同部位肿瘤患者间无明显差异（P＞0.05），说明Ag-NORs检测对任何部位肿瘤患者存在普遍临床意义。其中手术后无转移存活5年以上的患者，结果说明其免疫功能状态有了好转。Ag-NORs的检测应避开感染、炎症及治疗过程。肿瘤在放疗中有明显上升，在放疗后又逐步下降，但2～4周趋于稳定。这可能与肿瘤放疗引起的炎症有关，准确原因有待进一步研究。另外，用于高危人群的肿瘤普查有一定的临床价值。

[1] 王瑞年.Ag-NOR肿瘤研究的一项新指标(综述)[J].国外医学(肿瘤分册),1995,15(5):22-26.

[2] Crocker J,Paramjit Nar.Nacleoiar crganlzer regions in lymphomas[J]. J Pathology,2000,151:111-118.

The leukomonocyte Ag-NORs Detection and Analysis in 35 Cases Patients with Malignant Neoplastic Disease

Gao Lianxiang Hu Yankun Wang Ying Jia Haiyan Li Xia RenRui

ObjectiveThe nucleolus organizer regions(NORs)are composed by ribosome(RI)RNA genes.Theseregions control and regulate the acor-nonhistone protein transcriptived by rRNA,and also can be stained by argent nitrate (AgNO3)-Ag-NOR.The numbers,distribution and intensity of Ag-NOR in tumor cells(TC)can be used as significant index in the diagnose,cell typing,cell differentiation ranking of tumor.In case of the toxic effects of related molecule in TC,there are some differences in the expression of acor-nonhistone protein in the nucleolus organizer regions(NORs)between the patients with malignant tumor and non-malignant tumor,this can be used as a method of the diagnose of tumor and the monitoring of pathogenetic condition.MethodsThe KL-model image analytical system of tumor immunity was provide by Beijing JIANERKANG medical treatment facility company,Ltd.Other materials included 5%AgNO3 and the proportional silver staining reagent,and the RPMl 640 culture solution.The ordinary silver staining technique was used to stain peripheral-blood lymphocytes of the patients.ResultsThe contrast study of the activity of leukomonocyte acor-nonhistone protein expression were done in 70 health adult and patients with different tumor diseases,and remarkable difference was found between the patients with tumor diseases and health people.28 cases were positive results among 35 cases of tumor patients,which with statistical significance. This indicated the I.S% positive result was comparatively closed relation with tumors.This result is in accordance with some related literature reports.ConclusionThe detection of Ag-NORs of the peripheral-blood T-lymphocytes can be used as an important reference index in the diagnose of malignant tumor and the monitoring of pathogenetic condition.

KL-model image analytical system;The detection of T-leukomonocyte Ag-NORs;Tumor

R730.4

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1673-5846(2014)01-0159-03

总参工程兵直属医院，北京 100857