王莹莹,刘伟杰,杜钢军

(河南大学药学院药物研究所,河南开封475004)

皂角刺抗肿瘤的初步研究

王莹莹,刘伟杰,杜钢军*

(河南大学药学院药物研究所,河南开封475004)

目的 观察皂角刺水煎液的体内外抗肿瘤作用。方法 体内实验:建立小鼠背部皮下移植性实体肿瘤H22荷瘤动物模型,灌胃给药后测定肿瘤体积、质量及免疫器官指数;体外实验:用MTT法测定皂角刺对小鼠lewis肺癌细胞的影响。结果 体内实验:在本实验剂量下(0.3 m L/g),与模型对照组比较,皂角刺组肿瘤生长减缓,抑瘤率为38.37%,胸腺指数、脾脏指数均增高;体外实验:实验所用浓度的皂角刺水煎液呈剂量依赖性抑制小鼠lewis肺癌细胞生长。结论 皂角刺有一定抗肿瘤作用,其机制可能与细胞毒和提高机体免疫作用有关。

皂角刺;H22;lewis;MTT

近年来,在世界范围内,几乎所有的肿瘤发生率都呈上升趋势。中药在改善肿瘤患者体质、降低化疗药物的毒性、增强化疗药物的疗效方面独具特色[1]。中药及其复方制剂由于多种活性成分并存,通过多种途径、多个靶点、多种方式在肿瘤的治疗中发挥作用,因此,更引人注目。皂角刺,又称皂角针,是豆科皂荚属植物皂荚(Gleditsia sinensis Lam)的干燥棘刺,主要产于河南、江苏、湖北等地,全年均可采收,民间及临床应用历史悠久,具有广泛的药用价值。皂角刺是一种传统中草药,具有调节免疫、抗凝血、抗癌等功效。本品味辛,性温,专功消肿排脓,中医临床用于痈疽、肿毒,均有较好的治疗效果,一般表现为脓未成者可消,脓已成者可使之速溃[2]。中药皂角刺中含有多种皂苷、黄酮、三萜等黄酮类[3]生物活性成分,作用广泛。

目前,国内外对皂角刺抗肿瘤活性的研究报道相对较少。我们认为,皂角刺在抗体表肿瘤方面有增效的作用。本实验采用H22肝癌细胞皮下移植动物模型评价皂角刺的体内抗肿瘤作用,以期为皂角刺用于肿瘤治疗提供有价值的资料,为药用植物应用于抗肿瘤理论加以补充,更为了指导临床正确使用皂角刺对肿瘤的治疗。实验结果表明,皂角刺能使小鼠体表肿瘤逐渐缩小,从而延长荷瘤小鼠生存时间,阻止小鼠肿瘤自发转移,对小鼠体表肿瘤有确切的治疗作用。以下是我们对皂角刺抗肿瘤作用的初步研究。

1 材料

1.1 药品

中药皂角刺:皂角刺150 g与适量水煎煮30 min (煮沸后,转文火后开始计时)以上,重复煎煮3次,收集齐3次水煎液,静置后,取上清液浓缩至80 m L左右,移至瓶中,置于冰箱,4℃保存,供实验动物使用。无菌过滤滤液,供细胞实验使用。

1.2 试剂

DMEM培养液(美国GIBCO公司);胰酶(美国GIBCO公司);MTT(美国Sigma公司);DMSO(郑州派尼化学试剂厂);生理盐水等。

1.3 动物与瘤株

昆明小鼠,雌性,22～25 g,河南省医学实验动物中心提供(合格证号:豫动合字101号);H22肝癌,本实验室于昆明小鼠在体传代保存;lewis肺癌细胞,河南大学药学院药理实验室传代培养提供。

1.4 仪器

HDL洁净台 (北京东联哈尔仪器制造有限公司);快速混匀器SK-1(常州国华电器有限公司); El X800酶标仪(美国BIO-IEK公司);TDL-508台式离心机(上海安亭科学仪器厂);YN-ZD-2电热蒸馏水器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂);LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂);CHA-S恒温振荡器(常州国华电器有限公司); BD-400冰柜(河南冷柜厂);电子天平(上海精密仪器有限公司)。

2 方法

2.1 对H22小鼠肝癌皮下移植肿瘤的影响

取荷生长良好的腹水型肝癌昆明小鼠处死,取腹水,加无菌生理盐水稀释至原腹水的6～8倍,使成5×106个细胞/m L的稀释液。于20只状态良好的小鼠后肢右背部皮下接种0.2 m L/只。将接种后的小鼠按体质量平均分为模型组和皂角刺组,每组10只。其中模型组:灌胃清水0.3 m L/10 g;皂角刺组:灌胃皂角刺水煎液0.3 m L/10 g。方法均为每天早晚各1次,每次给药间隔8 h以上。肿瘤接种后即日开始给药,连续灌胃3周。

治疗期间,2 d监测小鼠体质量1次,待肿瘤长出后用游标卡尺每隔2 d测肿瘤长和宽1次,肿瘤体积按下列公式计算:

肿瘤体积(mm3)=肿瘤长度×肿瘤宽度×肿瘤宽度/2。

全程治疗结束后次日处死小鼠,眼球取血,剥离背部肿瘤、肝脏、脾脏和胸腺,并称重。计算肿瘤抑制率及肝脏、胸腺、脾脏指数。同时,观察小鼠肺部等其他脏器是否正常。

脏器指数%=内脏器官质量(mg)/处死当日体质量(g)×100;肿瘤抑瘤率(%)=(1-T/C)× 100%。

式中:C为模型组平均瘤质量(g);T为皂角刺组平均瘤质量(g)。

2.2 对lewis肺癌细胞生长的影响

取lewis肺癌传代细胞,加3 m L胰酶消化,振荡摇匀,加入2 m L培养基以中和胰酶,离心2次,弃去上清液,加入培养基吹打均匀,在细胞计数板上计数,调整细胞浓度,吹打成单细胞悬液,备用。上述细胞点入96孔培养板,每孔100μL,另设置空白对照组及4个浓度梯度给药组(药物用培养基稀释),每组设置4个平行对照孔,分别加入空白培养基100μL,50倍稀释药物100μL,100倍稀释药物100μL,200倍稀释药物100μL,400倍稀释药物100μL,置于体积分数为5%CO2培养箱内37℃培养48 h,弃去药物,加入5 g/L的MTT 100μL/孔,放置4 h后,加入DMSO 100μL/孔,置于酶标仪于570 nm测OD值,计算抑制率。

肿瘤抑制率(%)=(1-给药组OD值/模型组OD值)×100%。

2.3 统计学处理

3 结果

3.1 对H22肝癌荷瘤小鼠体质量、肿瘤及免疫器官的影响

体内实验结果显示,与模型组小鼠相比较,P≥0.05,给药组的体质量未见显著性差异,见图1;给药组的肿瘤生长速度较慢,见图2;小鼠生长状态较好,且给药组小鼠的存活率亦未见显著差异,见图3。肿瘤逐渐化脓溃烂缩小,皂角刺对荷瘤小鼠H22肝癌有一定的抑制作用,抑瘤率为38.37%,免疫器官指数有所提高,见表1。

3.2 皂角刺对小鼠lewis肺癌的抑制作用

体外实验结果显示,随药物浓度的改变抑制率也有所改变,药物浓度升高,则抑制率升高,当抑制率升高至200 mg/L浓度时,对癌细胞抑制作用最强,见表2。

图1 H22荷瘤小鼠体质量生长曲线

图2 H22荷瘤小鼠肿瘤体积生长曲线

图3 H22荷瘤小鼠存活曲线

表1 皂角刺对H22肝癌荷瘤小鼠免疫器官及瘤质量的影响(±s,n=10)

表1 皂角刺对H22肝癌荷瘤小鼠免疫器官及瘤质量的影响(±s,n=10)

注:与对照组比较,*P＜0.05。

组别 剂量/(m L/10 g) 瘤质量/(g) 胸腺指数/(mg/g) 脾脏指数/(mg/g) 肝脏指数/(mg/g)模型组 - 2.08±0.67 0.59±0.52 6.49±1.63 61.48±8.81皂角刺组 0.2 1.28±1.16*1.20±0.88*8.13±1.76*58.91±5.19

表2 皂角刺对lewis肺癌细胞的抑制率

4 讨论

近代药理研究表明,皂角刺具有消肿、脱毒、排脓、杀虫、抗菌、抗炎、抗病毒、免疫调节、抗凝血和抗癌等药理活性[2],皂角刺含有黄酮、皂荚皂苷、棕榈酸、硬脂酸、油酸、氨基酸、亚甾醇、谷甾醇、二十九碳烷、酚类等,其中的抗肿瘤活性成分主要有皂苷、黄酮、酚类和氨基酸等,能抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡及抑制肿瘤细胞的侵袭等。黄酮类化合物是较早发现的具有较好抗肿瘤作用的物质,研究皂角刺总黄酮的抗肿瘤特点和潜在的作用机制对于理解皂角刺的抗肿瘤作用及从中发现新型抗肿瘤药物均有重要意义[4-5]。

中药的抑瘤率大于30%,并经统计学处理有显著性差异时,可继续实验,连续3次实验,疗效稳定,则评价此药有一定的疗效[6]。本次实验抑瘤率为38.37%,显示皂角刺对肿瘤的生长有一定的抑制作用。

长期以来,人们一直认为机体的免疫系统在肿瘤演进的过程中能够清除肿瘤、保护自身,随着研究的逐步加深越来越多的证据表明,肿瘤浸润的免疫细胞不但不能发挥抗肿瘤作用,反而促进肿瘤生长、侵袭与转移[7]。而免疫系统功能正常与否与肿瘤治疗成败有着重要的关系,免疫治疗本身也是现代肿瘤治疗的一个重要组成部分。本次实验中,皂角刺组的肝指数稍微下降,免疫器官指数有所提高,脾淋巴细胞有增殖作用,提示皂角刺有一定抗肿瘤作用,并能增强机体发挥免疫作用,其潜在抗肿瘤作用可能是通过提高免疫作用实现的。

综上所述,皂角刺有一定的抗肿瘤作用,也有潜在促进肿瘤发生转移的可能,对肿瘤细胞的生长有抑制作用,但在肿瘤治疗应用中需注意应用方式。促进脾淋巴细胞的增殖提高免疫力[8],需要进一步研究该药的用量,进而为肿瘤的治疗提供有利条件。另外,皂角刺是否对部分肿瘤可表现为直接抑制作用有待进一步实验研究。

[1]Paraparesis K T,Kalemi T G,Zambouli D,et al.Synergistic effects of protein tyrosine kinase inhibitor genistein with camptothecins against three cell lines in vitro[J]. Cancer Lett,2006,233(2):255—256.

[2]张德发,杨晓娇.浅谈中医药治疗肿瘤的作用与机制[J].求医问药,2012,10(9):60-61.

[3]刘明华,黄兴武,肖顺汉,等.皂角刺提取物对荷瘤小鼠肿瘤生长及细胞因子的影响[J].肿瘤防治研究,2009,11 (36):365-367.

[4]陈海霞.皂角刺抗肿瘤作用有效成分研究进展[J].四川生理科学杂志,2010,32(1):35-37.

[5]徐哲,陈晓辉,王漪檬,等.皂角刺抗肿瘤活性成分的分离鉴定与活性测定[J].沈阳药科大学学报,2008,25(2): 108-111.

[6]杜钢军,时小燕.治疗癌症的新途径:靶向肿瘤微环境[J].国际药学研究杂志,2011,38(5).336-340.

[7]蒋志平,彭骞,何周康.皂角刺的现代研究进展[J].儿科药学杂志,2008,14(5):57-59.

[8]陈红,张建华,许晓群,等.苏木精染色法测定化疗药物对贴壁肿瘤细胞毒性作用的实验研究[J].中华肿瘤防治杂志,2010,17(11):374-375.

[责任编辑 时 红]

Preliminary study of Spina Gleditsiae on anti-tumor

WANG Yingying，LIU Weijie，DU Gangjun*
（Institute of Pharmacy，Pharmaceutical College of Henan University，Kaifeng，Henan 475004，China）

Objective To observe antitumor effects of spina gleditsiae water extract in vitro and in vivo.Methods In vivo：the subcutaneous model of H22 liver cancer was established to observe antitumor by measuring the volume，weight of in situ tumor and immune organs index after ig of spina gleditsiae water extract.In vitro：MTT assay is used to test antitumor effects of spina gleditsiae water extract on lewis lung cancer cells.Results In vivo：compared with model control group，the tumor size in spina gleditsiae group was smaller，the inhibitionory rate was 38.37%，at the same time，the thymus index and spleen index increased.In vitro：spina gleditsiae water extract inhibited proliferation in a concentration dependent matter.Conclusion Spina gleditsiae have antitumor activity，its mechanism might be related to cytotoxity and immune modulation.

Spina Gleditsiae；H22；lewis；MTT

R285.5

A

1672-7606(2014)02-0088-03

2013-09-30

国家自然科学基金项目(81173094);河南省高校青年骨干教师项目(2010GGJS-025);河南省科技厅重点攻关项目(112101310308);河南大学省部共建项目(SBGJ090704)。

王莹莹(1986-),女,河南商丘人,硕士研究生,从事中药抗肿瘤药理学研究工作。

*通讯作者:杜钢军(1971-),男,博士,教授,博士,从事中药抗肿瘤药理学的研究工作。