马宗琪，衣 宁，赵文倩，邱念伟

生物学实验中标准曲线的绘制

马宗琪，衣 宁，赵文倩，邱念伟

（曲阜师范大学 生命科学学院，山东 曲阜 273165）

标准曲线的制作是生物学实验的一项重要内容，正确绘制标准曲线是获得准确可靠实验数据的前提。文中以蛋白质标准曲线为例，详细介绍了标准曲线的数学求解方法和Excel操作方法，避免了以往徒手绘制标准曲线的误差，从而快速地绘制出最好的标准曲线。

标准曲线；生物学实验；绘制方法；直线回归

很多生物学实验中均需要绘制标准曲线，如生物材料中各类化合物或矿质元素含量的测定、酶活性的测定、细菌生物量的测定等。这些实验中标准曲线的绘制大多仍以传统的坐标纸法为主，这种徒手绘制的标准曲线主观性较强，实验误差较大。如，手工绘制标准曲线时，即使数据相同，每个人画出的标准曲线都不相同，可以绘制出无数条回归直线，哪条直线最好呢？统计学上的“最小二乘法”原理告诉我们，每个数据点距离回归直线的离差平方和最小的直线是最好的回归线［1］。根据这一原理，利用微积分学中的求极值的方法，可以求出回归直线的斜率和截距，从而得到最好的标准曲线。

由于部分生物类专业的学生未学习统计学方面的课程，或者对Excel中统计功能不熟悉，不能熟练掌握上述绘制标准曲线的方法。绘制标准曲线的数学原理虽然比较复杂，但数据运算过程比较简单，具有中学数学知识的大学生均可轻松学会。尤其是有Excel办公软件的帮助，只需简单操作就可快速绘制出标准曲线。本文将标准曲线的计算原理进行简化，以生物学实验中经常用到的可溶性蛋白含量测定法（考马斯亮蓝法）为例［2］，介绍Excel办公软件绘制标准曲线的简单操作办法，使读者不仅知其然，也知其所以然。

1 标准曲线的统计学原理和求解过程

在酸性环境中，棕红色的考马斯亮蓝G250通过疏水力与蛋白质相结合生成蓝色化合物，在595mm处有最大光吸收，颜色深浅与蛋白质含量呈正比［3］。该法测定可溶性蛋白含量操作简便、灵敏快速、干扰少，是生物化学实验中使用率最高的方法之一。测定时，以牛血清蛋白作为标准样品，本文测得的标准样品的A595数据如表1所示。

1.1 标准曲线一元一次回归模型的说明

因为标准样品中蛋白质浓度与吸光度A595呈直线关系，因此，两个变量间的关系可用Y=a+bX表示。其中，b称为回归系数；a称为回归截距。一般把可控变量作为自变量X，因此，把标准蛋白质浓度作为X，吸光度A595作为Y。根据最小二乘法原理，可用下式求出a值和b值。

表1 蛋白质浓度与吸光度A595的相关性

1.2 a值和b值求解过程

分别代入式（1）和式（2）得：

所以，蛋白质浓度（X）与吸光度A595（Y）的标准曲线方程为：

这样，测得未知浓度的蛋白质样品的吸光度后，就可以代入标准曲线方程计算出样品的蛋白质浓度了。注意：X为蛋白质浓度，Y为吸光度，是代入Y求X。

表2 a值和b值求解过程

1.3 过原点的标准曲线求解方法

绘制蛋白质浓度标准曲线时，一般要使直线通过原点，即当蛋白质浓度为零时，要将吸光度调零，以消除本底干扰。这时截距a=0，斜率b的计算公式如下：

b值的求解过程如表3所示。由表3得：

代入式（3）得：

所以，蛋白质浓度（X）与吸光度A595（Y）过原点的标准曲线方程为：

表3 曲线过原点时b值求解过程

2 用Excel获得标准曲线方程的方法

标准曲线可由a和b两个参数决定，故只需求出a和b。虽然仅是加减乘除和开方运算，但运算过程较烦琐，手动计算时容易出错。Excel办公软件中有编写好的运算函数，可以帮助我们自动求出a和b；也可以用Excel中的散点图自动求出标准曲线方程。操作过程既简便又快速。

2.1 用Excel函数求a值和b值

首先，将X值和Y值依次输入Excel表格，如图1所示；然后，在任意空白单元格输入Excel函数。求a值的Excel函数为“Intercept”，求b值的Excel函数为“Linest”。

具体方法如下：

1）求a值。在任意空白单元中输入“=intercept（y's，x's）”，在“y's”处输入Y值所在区域，在“x's”处输入X值所在区域，按回车键就会自动计算出a值。举例来说，如果蛋白质浓度数据在单元格B1至H1，吸光度A595数据在单元格B2至H2，则输入“=intercept（B2：H2，B1：H1）”，按回车键后，单元格显示“0.014 5”，就是a值。

图1 用Excel函数求a值和b值方法演示

2）求b值。在任意空白单元格输入“=linest（y's，x's，true or false）”，在“y's”处输入Y值所在区域，在“x's”处输入X值所在区域，并输入true或者false，按回车键就会自动计算出b值。“true”表示截距不为0，“false”表示截距必须为0。举例来说，如果在单元格中输入“=linest（B2：H2，B1：H1，true）”，按回车键后，单元格显示数字“0.757 6”；在单元格中输入“=linest（B2：H2，B1：H1，false）”，按回车键后，单元格显示数字“0.777 9”。

注意：Excel函数输入时不分大小写，函数名称前要输入“=”号，名称后要输入“（）”号。“（）”中Y值在前，X值在后，不可颠倒，X值和Y值排列顺序也要一致。

2.2 用Excel散点图求a值和b值

用Excel中的散点图同样可以自动求出标准曲线的a值和b值，并绘制出标准曲线图。具体操作方法为：将X值和Y值依次输入Excel表格，按左键用鼠标选中数据，点击窗口上方的“插入”，选“图表”，再选对话框中的“散点图”，点击“完成”。Excel就自动画出了标准曲线的散点图，如图2所示。

用鼠标左键选中图中数据点，点击右键，选“添加趋势线”，在对话框的回归线“类型”中选“直线”。在“选项”中点击“显示公式”，若需要截距为零，则再点击“设置截距=0”，也可以点击“显示R平方值”，以帮助判断标准曲线的优劣。点击“确定”，就可得到蛋白质标准曲线图和曲线方程。

图2 用Excel绘制的标准曲线

3 结束语

虽然用Excel办公软件可以快速准确地获得标准曲线，但学生也应掌握标准曲线的运算过程，才能做到“既知其然，又知其所以然”。至于最小二乘法原理，学生可以不必深究，只要知道用这种方法获得的标准曲线与实验值误差最小，是最好的回归线就可以了。传统的坐标纸法绘制标准曲线已经不适合现代生物学实验需要，本文介绍的方法可以在大学生物学实验中推广。

［1］李春喜，邵云，姜丽娜.生物统计学［M］.4版.北京：科学出版社，2008：124－133.

［2］张志良，瞿伟菁，李小方.植物生理学实验指导［M］. 4版.北京：高等教育出版社，2009：125－126.

［3］Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantization ofmicrogram quantities of protein utilizing the principle of protein－dye binding［J］.Anal.Biochem，1976，72：248－254.

Protract of Standard Curve in Biological Experiments

MA Zongqi，YINing，ZHAOWenqian，QIU Nianwei
（College of Life Science，Qufu Normal University，Qufu 273165，China）

Protract standard curve is an important content in biological experiments.Correct curvemaking is the basis to obtain accurate and reliable experimental data.In this paper，we take protein standard curve as an example and introduce the computingmethods and operation method by Excel.Thismethod can avoid the errors in freehand standard curve and can create the best standard curve quickly.

standard curve；biological experiments；creatingmethod；linear regression

Q－33；Q51

B

10.3969/j.issn.1672－4550.2014.05.003

2013－10－16

国家级大学生创新创业训练计划资助项目（2013A048）；曲阜师范大学教学改革资助项目（JG－ZZ12053）。

马宗琪（1964－），男，大学，实验师，主要从事实验室管理和生物实验技术研究工作。