陈旸升等

摘 要：结合电子克隆及RT-PCR技术获得条斑紫菜（Porphyrayezoensis）过氧化物酶基因。该基因cDNA序列长847 bp，包含编码245个氨基酸的开放阅读框。生物信息学分析结果显示，该基因编码蛋白无信号肽序列，与高等植物拟南芥的细胞质抗坏血酸过氧化物酶蛋白序列同源性较高，在细胞质中行使功能。此外，该基因的进化历程基本符合植物从低等到高等的进化过程。

关键词：条斑紫菜；抗坏血酸过氧化物酶；克隆；生物信息学

中图分类号：S968.43+1 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.04.003

植物在干旱、高盐、低温、高温等逆境中产生过量的活性氧基团（Reactive oxygen species，ROS），细胞内高浓度的ROS会引起细胞凋亡甚至坏死。抗坏血酸过氧化酶（Ascorbate peroxidase，APX）是一类清除体内过氧化氢的酶，对于植物和藻类不可缺少，它保护叶绿体及其他细胞器免受过氧化氢和由过氧化氢分解的羟基造成损伤。APX是植物抗坏血酸-谷胱甘肽循环中的关键酶之一[1]。APX属于多基因家族，由植物细胞质、叶绿体、线粒体、过氧化物酶等细胞器中的多条同源基因组成[2]。大量研究表明，非生物胁迫条件下，植物以APX基因迅速表达、体内抗坏血酸含量变化来响应胁迫信号[3-6]。同时，大量APX基因过表达和抑制表达的转基因植物均不同程度地提高了对氧化胁迫环境的抵抗能力[7-9]。

条斑紫菜（Porphyrayezoensis）属于红毛藻纲，由于它可以小规模培养，生长周期短（实验室条件2～3月），基因组比较小（260 Mbp），适合作为研究海藻生理学和分子生物学的模式生物而得到广泛关注。目前，已经可以得到条斑紫菜配子体和孢子体的大量EST序列。条斑紫菜生长在潮间带，长期暴露于空气，处于高盐等恶劣环境中，这也使它成为研究藻类响应非生物胁迫的优良材料[10]。本研究克隆了条斑紫菜APX基因的cDNA序列，进行了序列测定和生物信息学分析，为该基因在藻类中的作用机理和利用该基因进行作物耐盐转基因改良奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

条斑紫菜叶状体采自大连旅顺黄金山近海海域。Qiagen Rneasy Plant Mini试剂盒购自Qiagen公司，PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒、TAKARA LA Taq和dNTPs购自TAKARA公司，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，DEPC、乙醇等其他试剂均购自国内外相关公司。

1.2 条斑紫菜叶状体总RNA提取

取100 mg材料经液氮研磨成粉末，用RNeasy Plant Mini试剂盒提取总RNA，按实验指导书进行，电泳检测RNA质量和提取量，-20 ℃保存。

1.3 引物设计及基因克隆

在条斑紫菜EST数据库中以ascorbate peroxidase为关键词进行搜索，将得到的结果下载存盘，利用DNAman软件进行序列拼接，重叠序列拼接后用NCBI的ORF Finder在线预测开放阅读框，推测其编码的氨基酸序列。针对开放阅读框设计一对引物：上游5`-CACCGCTGCCTGATCGTGCT-3`，下游5`-CAAACAACCAAGTGGCGGCTAC-3`，预计扩增长度847 bp，包含APX基因完整ORF。

取总RNA2 μL，以Oligo（dT）为引物，用PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒按说明书合成cDNA第一链。以合成的第一链为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为50 μL，其中10×LA PCR Buffer II （Mg2+ Plus）5 μL，dNTP Mixture （各2.5 mmol·L-1）8 μL，上、下游引物各1 μL，LA taq（5 U·μL-1）0.5 μL，模板2 μL，水32.5 μL。

PCR扩增程序如下：94 ℃、3 min；94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，30个循环；72 ℃、10 min。反应后取5 μL产物电泳。将PCR产物送生工测序。

1.4 生物信息学分析

利用NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）的BLAST软件对测序结果进行分析，用SIGNALp4.0分析信号肽。收集NCBI数据库中的不同物种的APX序列，使用clustalW程序进行多序列比对，保守结构域分析利用prosite（http：//prosite.expasy.org/）和NCBI中的CDD预测工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/）进行预测，然后用MEGA5.1进化分析树构建系统发生树。

2 结果与分析

2.1 条斑紫菜APX基因的克隆与序列测定

以ascorbate peroxidase为关键词在条斑紫菜EST数据库中检索，得到AV43956、AV433118、AU189028、AU189855、AV433538等多条高度相似并彼此重叠的EST序列，拼接后得到一条1 041 bp的序列。PCR产物大小为847 bp（图1、图2），与预期大小相符，含有完整的ORF。

2.2 条斑紫菜APX基因的生物信息学分析

条斑紫菜APX基因编码蛋白的保守结构域预测（图3）。此蛋白具有高度保守的底物结合区域，属于植物过氧化物酶超家族的一员。

拟南芥中的8种APX蛋白分布于不同的细胞器内，成员之间同源性较低。选取这8种APX蛋白的氨基酸序列与条斑紫菜APX蛋白的氨基酸序列进行比对。结果表明，条斑紫菜APX蛋白与拟南芥细胞质基质中的APX蛋白（AtAPx01，AtAPx02）同源性最高，为51%～54%。该基因与其他几条APX蛋白的氨基酸序列同源性较低，为12%～48%。信号肽分析结果显示，此序列不含信号肽，所以这条APX基因可能为细胞质基质APX。

将条斑紫菜APX编码蛋白与拟南芥（AtAPX）、辣椒（CfAPX）、番茄（SlAPX）、棉花（GhAPX）、甜菜（BvAPX）、大豆（GmAPX）、水稻（OsAPX）、玉米（ZmAPX）、大麦（HvAPX）、小立碗藓（PpAPX）、两种温泉红藻（CcAPX，GaAPX）、莱茵衣藻（CrAPX）、小球藻（CvAPX）的蛋白进行同源分析，然后用MEGA软件邻接法（NJ法）构建系统进化树（图4）。从结果可以看出，双子叶植物聚为一类，单子叶植物水稻、玉米、大麦，聚为一类。苔藓植物小立碗藓处在藻类与高等植物之间的过渡位置。条斑紫菜与两种温泉红藻亲缘关系较近。绿藻处于进化树的底部。其中红藻和绿藻中的单细胞藻类分别处于各自分枝的底部。聚类结果与来源物种的系统发育模式一致。节点自展值较高，可以认为得到的进化树结果可信。由此可见，抗坏血酸过氧化物酶基因的进化历程基本符合植物从低等到高等的进化过程。

3 结 论

运用电子克隆及RT-PCR技术得到条斑紫菜叶状体抗坏血酸过氧化物酶基因的cDNA序列。该基因编码蛋白无信号肽，其蛋白结构域与高等植物相似，与其他藻类抗坏血酸过氧化物酶蛋白亲缘关系接近，于细胞质中行使功能。由于藻类中的相关报道较少，本研究为藻类中抗坏血酸相关生理生化过程的研究奠定了基础。

参考文献：

[1] Shigeoka S. Regulation and function of ascorbate peroxidase isoenzymes[J]. J Exp Bot， 2002， 53（372）： 1 305-1 319.

[2] Jimenez A. Evidence for the presence of the ascorbate-glutathione cycle in mitochondria and peroxisomes of pea leaves[J]. Plant Physiol， 1997， 114（1）：275-284.

[3] Hemavathi. Enhanced ascorbic acid accumulation in transgenic potato confers tolerance to various abiotic stresses[J]. Biotechnol Lett， 2010，32（2）： 321-330.

[4] Diaz-Vivancos P. Ectopic expression of cytosolic superoxide dismutase and ascorbate peroxidase leads to salt stress tolerance in transgenic plums[J]. Plant Biotechnol J， 2013， 11（8）：976-985.

[5] Zhang Z. Gene knockout study reveals that cytosolic ascorbate peroxidase 2（OsAPX2） plays a critical role in growth and reproduction in rice under drought， salt and cold stresses[J]. PLoS One， 2013，8（2）： 57 472.

[6] Li Z Q， Li J X， Zhang G F. Expression regulation of plant ascorbate peroxidase and its tolerance to abiotic stresses[J]. Yi Chuan， 2013，35（1）： 45-54.

[7] Danna C H. Thylakoid-bound ascorbate peroxidase mutant exhibits impaired electron transport and photosynthetic activity[J]. Plant Physiol， 2003，132（4）：2 116-2 125.

[8] Wang W， Vinocur B， Altman A. Plant responses to drought， salinity and extreme temperatures： towards genetic engineering for stress tolerance[J]. Planta， 2003，218（1）： 1-14.

[9] Gupta A S. Overexpression of superoxide dismutase protects plants from oxidative stress （induction of ascorbate peroxidase in superoxide dismutase-overexpressing plants）[J]. Plant Physiol， 1993，103（4）：1 067-1 073.

[10] Uji T. Molecular characterization and expression analysis of sodium pump genes in the marinered alga Porphyra yezoensis[J]. Mol Biol Rep， 2012，39（8）： 7 973-7 980.

将条斑紫菜APX编码蛋白与拟南芥（AtAPX）、辣椒（CfAPX）、番茄（SlAPX）、棉花（GhAPX）、甜菜（BvAPX）、大豆（GmAPX）、水稻（OsAPX）、玉米（ZmAPX）、大麦（HvAPX）、小立碗藓（PpAPX）、两种温泉红藻（CcAPX，GaAPX）、莱茵衣藻（CrAPX）、小球藻（CvAPX）的蛋白进行同源分析，然后用MEGA软件邻接法（NJ法）构建系统进化树（图4）。从结果可以看出，双子叶植物聚为一类，单子叶植物水稻、玉米、大麦，聚为一类。苔藓植物小立碗藓处在藻类与高等植物之间的过渡位置。条斑紫菜与两种温泉红藻亲缘关系较近。绿藻处于进化树的底部。其中红藻和绿藻中的单细胞藻类分别处于各自分枝的底部。聚类结果与来源物种的系统发育模式一致。节点自展值较高，可以认为得到的进化树结果可信。由此可见，抗坏血酸过氧化物酶基因的进化历程基本符合植物从低等到高等的进化过程。

3 结 论

运用电子克隆及RT-PCR技术得到条斑紫菜叶状体抗坏血酸过氧化物酶基因的cDNA序列。该基因编码蛋白无信号肽，其蛋白结构域与高等植物相似，与其他藻类抗坏血酸过氧化物酶蛋白亲缘关系接近，于细胞质中行使功能。由于藻类中的相关报道较少，本研究为藻类中抗坏血酸相关生理生化过程的研究奠定了基础。

参考文献：

[1] Shigeoka S. Regulation and function of ascorbate peroxidase isoenzymes[J]. J Exp Bot， 2002， 53（372）： 1 305-1 319.

[2] Jimenez A. Evidence for the presence of the ascorbate-glutathione cycle in mitochondria and peroxisomes of pea leaves[J]. Plant Physiol， 1997， 114（1）：275-284.

[3] Hemavathi. Enhanced ascorbic acid accumulation in transgenic potato confers tolerance to various abiotic stresses[J]. Biotechnol Lett， 2010，32（2）： 321-330.

[4] Diaz-Vivancos P. Ectopic expression of cytosolic superoxide dismutase and ascorbate peroxidase leads to salt stress tolerance in transgenic plums[J]. Plant Biotechnol J， 2013， 11（8）：976-985.

[5] Zhang Z. Gene knockout study reveals that cytosolic ascorbate peroxidase 2（OsAPX2） plays a critical role in growth and reproduction in rice under drought， salt and cold stresses[J]. PLoS One， 2013，8（2）： 57 472.

[6] Li Z Q， Li J X， Zhang G F. Expression regulation of plant ascorbate peroxidase and its tolerance to abiotic stresses[J]. Yi Chuan， 2013，35（1）： 45-54.

[7] Danna C H. Thylakoid-bound ascorbate peroxidase mutant exhibits impaired electron transport and photosynthetic activity[J]. Plant Physiol， 2003，132（4）：2 116-2 125.

[8] Wang W， Vinocur B， Altman A. Plant responses to drought， salinity and extreme temperatures： towards genetic engineering for stress tolerance[J]. Planta， 2003，218（1）： 1-14.

[9] Gupta A S. Overexpression of superoxide dismutase protects plants from oxidative stress （induction of ascorbate peroxidase in superoxide dismutase-overexpressing plants）[J]. Plant Physiol， 1993，103（4）：1 067-1 073.

[10] Uji T. Molecular characterization and expression analysis of sodium pump genes in the marinered alga Porphyra yezoensis[J]. Mol Biol Rep， 2012，39（8）： 7 973-7 980.

将条斑紫菜APX编码蛋白与拟南芥（AtAPX）、辣椒（CfAPX）、番茄（SlAPX）、棉花（GhAPX）、甜菜（BvAPX）、大豆（GmAPX）、水稻（OsAPX）、玉米（ZmAPX）、大麦（HvAPX）、小立碗藓（PpAPX）、两种温泉红藻（CcAPX，GaAPX）、莱茵衣藻（CrAPX）、小球藻（CvAPX）的蛋白进行同源分析，然后用MEGA软件邻接法（NJ法）构建系统进化树（图4）。从结果可以看出，双子叶植物聚为一类，单子叶植物水稻、玉米、大麦，聚为一类。苔藓植物小立碗藓处在藻类与高等植物之间的过渡位置。条斑紫菜与两种温泉红藻亲缘关系较近。绿藻处于进化树的底部。其中红藻和绿藻中的单细胞藻类分别处于各自分枝的底部。聚类结果与来源物种的系统发育模式一致。节点自展值较高，可以认为得到的进化树结果可信。由此可见，抗坏血酸过氧化物酶基因的进化历程基本符合植物从低等到高等的进化过程。

3 结 论

运用电子克隆及RT-PCR技术得到条斑紫菜叶状体抗坏血酸过氧化物酶基因的cDNA序列。该基因编码蛋白无信号肽，其蛋白结构域与高等植物相似，与其他藻类抗坏血酸过氧化物酶蛋白亲缘关系接近，于细胞质中行使功能。由于藻类中的相关报道较少，本研究为藻类中抗坏血酸相关生理生化过程的研究奠定了基础。

参考文献：

[1] Shigeoka S. Regulation and function of ascorbate peroxidase isoenzymes[J]. J Exp Bot， 2002， 53（372）： 1 305-1 319.

[2] Jimenez A. Evidence for the presence of the ascorbate-glutathione cycle in mitochondria and peroxisomes of pea leaves[J]. Plant Physiol， 1997， 114（1）：275-284.

[3] Hemavathi. Enhanced ascorbic acid accumulation in transgenic potato confers tolerance to various abiotic stresses[J]. Biotechnol Lett， 2010，32（2）： 321-330.

[4] Diaz-Vivancos P. Ectopic expression of cytosolic superoxide dismutase and ascorbate peroxidase leads to salt stress tolerance in transgenic plums[J]. Plant Biotechnol J， 2013， 11（8）：976-985.

[5] Zhang Z. Gene knockout study reveals that cytosolic ascorbate peroxidase 2（OsAPX2） plays a critical role in growth and reproduction in rice under drought， salt and cold stresses[J]. PLoS One， 2013，8（2）： 57 472.

[6] Li Z Q， Li J X， Zhang G F. Expression regulation of plant ascorbate peroxidase and its tolerance to abiotic stresses[J]. Yi Chuan， 2013，35（1）： 45-54.

[7] Danna C H. Thylakoid-bound ascorbate peroxidase mutant exhibits impaired electron transport and photosynthetic activity[J]. Plant Physiol， 2003，132（4）：2 116-2 125.

[8] Wang W， Vinocur B， Altman A. Plant responses to drought， salinity and extreme temperatures： towards genetic engineering for stress tolerance[J]. Planta， 2003，218（1）： 1-14.

[9] Gupta A S. Overexpression of superoxide dismutase protects plants from oxidative stress （induction of ascorbate peroxidase in superoxide dismutase-overexpressing plants）[J]. Plant Physiol， 1993，103（4）：1 067-1 073.

[10] Uji T. Molecular characterization and expression analysis of sodium pump genes in the marinered alga Porphyra yezoensis[J]. Mol Biol Rep， 2012，39（8）： 7 973-7 980.