武艳,杨岚,张羽飞,袁晓环,初彦辉

(1.牡丹江医学院医药研究中心,牡丹江 157011;2.牡丹江医学院红旗医院眼科,牡丹江 157011)

bFGF对成纤维细胞增殖和胶原及纤维连接蛋白的影响*

武艳1,杨岚2,张羽飞1,袁晓环1,初彦辉1

(1.牡丹江医学院医药研究中心,牡丹江 157011;2.牡丹江医学院红旗医院眼科,牡丹江 157011)

目的 探讨碱性成纤维细胞因子(bFGF)调节皮肤创伤修复的作用机制。方法采用组织块贴壁法培养来源于正常皮肤和增生性瘢痕的成纤维细胞(FB),加入含有不同浓度bFGF(0,0.1,1,10,100,1 000 ng·mL-1)的无血清培养液培养72 h,采用细胞计数法和锥虫蓝染色检测各组FB增殖和凋亡,酶联免疫吸附法(ELISA)和逆转录PCR (RT-PCR)分别检测Ⅰ型、Ⅲ型胶原和纤维连接蛋白浓度及基因表达情况。结果bFGF促进FB增殖,当浓度过高时则抑制FB增殖,促进其凋亡,并且增生性瘢痕FB增殖较来源于正常皮肤的FB缓慢;bFGF明显抑制增生性瘢痕FBⅠ型胶原产生,对来源于正常皮肤FB无影响;bFGF上调来源于正常皮肤FB的纤维连接蛋白基因表达,对增生性瘢痕FB中的表达无影响;bFGF对两种来源的FBⅢ型胶原的分泌和表达均无显著作用。结论bFGF对来源正常皮肤和增生性瘢痕的FB具有不同的影响和作用机制,可能对创伤修复早期和瘢痕形成过程发挥作用。

碱性成纤维细胞因子;成纤维细胞;增生性瘢痕;创伤修复

创伤修复是多种细胞因子、成纤维细胞(fibroblast,FB)及细胞外基质相互作用的复杂的动态过程。其中FB在创伤修复中通过分泌胶原和纤维连接蛋白形成临时支架而发挥重要作用[1]。而来源于单核巨噬细胞或淋巴细胞等的生长因子如转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)、碱性成纤维细胞因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)等能够吸引不用类型的细胞移动到创伤部位从而促进创伤修复[2]。已有研究证实bFGF对FB和内皮细胞具有趋化作用[3]。另外,也有研究证实bFGF可有效调节肉芽组织形成和胶原合成,从而促进无瘢痕修复[4],但其减少增生性瘢痕(hypertrophic scar,HS)、促进创伤修复的作用机制仍不清楚。Ⅰ型、Ⅲ型胶原和纤维连接蛋白是创伤修复中形成临时性支架的结构分子,笔者在本研究中拟采用不同浓度bFGF作用于来源于人正常皮肤和HS的FB,检测3种蛋白的表达,旨在探讨bFGF抑制瘢痕形成的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 达尔伯克伊格尔改良培养基(Dulbecco's modified eagle medium,DMEM,批号: 1036941)、青霉素和链霉素混合液(批号:1078516)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS,批号:1036489)、胰蛋白酶(批号:1081134)均购自美国Gibco公司;锥虫蓝(批号:0905291321)购自中国碧云天生物技术研究所;Trizol (批号:1173364)、反转录试剂盒(批号:998897)购自美国Invitrogen公司;Ⅰ型胶原(批号:E0040)、Ⅲ型胶原(批号:201210)和纤维连接蛋白(批号:201206)、酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒购于上海博谷生物科技有限公司;二氧化碳(CO2)恒温培养箱购自美国Thermo公司;倒置相差显微镜购自日本Olympus公司(型号:IX70-142);聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)仪购自德国Eppendorf公司(型号:5331)。

1.2 FB的培养 皮肤瘢痕组织取自6例(男、女各3例,年龄18～53岁)同期住院患者手术切除的创伤愈合成熟期的HS组织(以往没有接受过任何治疗),经病理组织学检查确诊。正常组织取自同期住院的非皮肤病经外科手术的患者皮肤。取材均得到患者知情同意,并经医院伦理委员会批准。将收集的皮肤组织切去表皮,并将标本切成约1 mm3小块,置于培养皿,待组织贴壁后,加入10%胎牛血清、含100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1链霉素的DMEM,置于37℃、5% CO2培养箱中培养。3 d后换液,之后每2～3 d更换培养液1次。显微镜下观察,待细胞基本爬满瓶底后,用0.25%胰蛋白酶消化后,按1∶3比例传代培养。实验所用细胞为3～5代,细胞融合达70%～80%后,加入含有不同浓度的bFGF(0,0.1,1,10,100, 1 000 ng·mL-1)无血清培养液继续培养72 h。

1.3 FB增殖和凋亡的检测 加入含不同浓度bFGF的无血清培养液继续培养72 h,胰酶消化,收集细胞。锥虫蓝染色,细胞计数器计数。重复3次。

1.4 ELISA检测Ⅰ型、Ⅲ型胶原和纤维连接蛋白浓度 皮肤FB条件培养液中Ⅰ型、Ⅲ型胶原和纤维连接蛋白的浓度采用ELISA检测,按照说明书检测方法操作,用酶标仪检测,波长450 nm。

1.5 反转录-聚合酶链反应(reverse transcriptionpolymerase chain reaction,RT-PCR)检测Ⅰ型、Ⅲ型胶原和纤维连接蛋白的表达 加入含有不同浓度bFGF的无血清培养液继续培养72 h,进行RNA提取、cDNA转录及PCR检测。RT-PCR的引物序列如下:Ⅰ型胶原:正义,5′-CAT GCC GTG ACT TGA GAC TCA-3′,反义,5′-AGG CGC ATG AAG GCA AGT T-3′;Ⅲ型胶原:正义,5′-CGA GCT TCC CAG AAC ATC ACA-3′,反义, 5′-TTC GTG CAA CCA TCC TCC A-3′;纤维连接蛋白:正义,5′-TTC CTT GCT GGT ATC ATG GCA-3′,反义, 5′-TAT TCG GTT CCC GGT TCC A-3′;β-actin:正义,5′-GCC CTG AGG CAC TCT TCC A-3′,反义,5′-GCG GAT GTC CAC GTC ACA-3′。PCR反应条件:95℃预变性5 min,94℃50 s、57℃50 s、72℃60 s,共30个循环,最后72℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳,80 V电泳25 min,凝胶成像仪照相存盘。

2 结果

2.1 bFGF对FB增殖和凋亡的影响 将来源于正常皮肤和HS的FB置于无bFGF和bFGF中培养,随着bFGF浓度的增加,FB增殖数量变化很大。当bFGF浓度为100 ng·mL-1时,来源于正常皮肤FB的增殖细胞数达到最高值,而来源于HS的FB在bFGF浓度为10 ng·mL-1时增殖达最高值。当bFGF浓度继续增加达到1 000 ng·mL-1时,两组FB细胞数都有所下降, bFGF对来源于HS的FB效果更明显,下降约68%,见表1。bFGF的浓度为1 000 ng·mL-1时,来源于HS的FB染色阳性的细胞数增加明显,而各种浓度的bFGF对来源于正常皮肤FB凋亡没有显著影响,见表2。

表1 不同浓度bFGF对来源于正常皮肤和HS的FB增殖的影响Tab.1 Effect of different concentration of bFGF on fibroblast proliferation of normal skin and hypertrophic scar 个,±s,n=10

表1 不同浓度bFGF对来源于正常皮肤和HS的FB增殖的影响Tab.1 Effect of different concentration of bFGF on fibroblast proliferation of normal skin and hypertrophic scar 个,±s,n=10

与未加入bFGF组比较,*1P＜0.05,*2P＜0.01Compared with fibroblasts not treated by bFGF,*1P＜0.05,*2P＜0.01

bFGF浓度/ (ng·mL-1)正常皮肤FB增殖/×105HS的FB增殖/×1050 8.25±0.8917.89±1.49 0.19.59±1.1220.46±1.56 1 16.72±1.89*129.18±2.46*11041.50±3.89*242.58±3.82*210055.14±4.12*229.80±2.01*11 00034.98±2.56*213.89±1.28

2.2 bFGF对FB分泌Ⅰ型、Ⅲ型胶原和纤维连接蛋白影响 无bFGF培养条件下,来源于HSFB分泌的Ⅰ型胶原比来源于正常皮肤FB高。而bFGF浓度越高,越会抑制HS的FB分泌Ⅰ型胶原;bFGF的浓度对来源于正常皮肤FB分泌Ⅰ型胶原无显著影响,见表3。bFGF对于这两种来源的FB影响来说,其Ⅲ型胶原无明显变化,见表4。在bFGF的影响下,来源于正常皮肤FB的纤维连接蛋白分泌增加,而HS的FB分泌无明显变化,见表5。

表2 不同浓度bFGF对来源于正常皮肤和HS的FB凋亡的影响Tab.2 Effect of different concentration of bFGF on fibroblast apoptosis of normal skin and hypertrophic scar 个,±s,n=10

表2 不同浓度bFGF对来源于正常皮肤和HS的FB凋亡的影响Tab.2 Effect of different concentration of bFGF on fibroblast apoptosis of normal skin and hypertrophic scar 个,±s,n=10

与未加入bFGF组比较,*1P＜0.01Compared with fibroblasts not reated by bFGF,*1P＜0.01

bFGF浓度/ (ng·mL-1)正常皮肤FB凋亡/×105HS的FB凋亡/×1050 3.10±0.213.15±0.02 0.13.20±0.253.16±0.26 1 3.19±0.293.21±0.27 103.21±0.313.19±0.31 1003.24±0.273.64±0.32 1 0003.18±0.265.79±0.48*1

表3 bFGF对来源于正常皮肤和HS的FB分泌的影响Tab.3 Effect of bFGF on fibroblasts secretion of normal skin and hypertrophic scar μg·mL-1·mg-1,±s

表3 bFGF对来源于正常皮肤和HS的FB分泌的影响Tab.3 Effect of bFGF on fibroblasts secretion of normal skin and hypertrophic scar μg·mL-1·mg-1,±s

与同组无bFGF培养的成纤维细胞比较,*1P＜0.01;与来源正常皮肤的FB比较,*2P＜0.01Compared with fibroblasts not treated by bFGF,*1P＜0.01; Compared with fibroblasts from normal skin,*2P＜0.01

bFGF浓度/ (ng·mL-1)正常皮肤FB (Ⅰ型胶原) HS的FB (Ⅰ型胶原) 0 0.019±0.0050.028±0.006*10.10.018±0.0030.018±0.004*11 0.016±0.0020.015±0.005*2100.017±0.0030.017±0.004*21000.018±0.0030.016±0.004*21 0000.016±0.0040.015±0.003*2

2.3 bFGF对FB的Ⅰ型、Ⅲ型胶原和纤维连接蛋白基因表达的影响 无bFGF培养条件下,来源于HS的FBⅠ型胶原的表达明显高于来源于正常皮肤的FB。HS的FB在bFGF浓度分别为1,10,100,1 000 ng·mL-1时,其Ⅰ型胶原的表达分别下降了52%,55%,61%,63%,而bFGF浓度对来源于正常皮肤FBⅠ型胶原的表达无影响。从图1中可以看到,bFGF对来源于HS的FB和来源于正常皮肤的FBⅢ型胶原的基因表达都没有显著影响。而纤维连接蛋白在HS的FB中表达无变化,在来源于正常皮肤的FB中表达增加。

表4 bFGF对来源于正常皮肤和增生性瘢痕的FBⅢ型胶原分泌的影响Tab.4 Effect of bFGF on type III collagen secretion by fibroblasts of normal skin and hypertrophic scar μg·mL-1·mg-1,±s

表4 bFGF对来源于正常皮肤和增生性瘢痕的FBⅢ型胶原分泌的影响Tab.4 Effect of bFGF on type III collagen secretion by fibroblasts of normal skin and hypertrophic scar μg·mL-1·mg-1,±s

bFGF浓度/ (ng·mL-1)正常皮肤FB (Ⅲ型胶原) HS的FB (Ⅲ型胶原) 0 0.190±0.0290.310±0.031 0.10.168±0.0270.297±0.029 1 0.172±0.0310.269±0.025 100.165±0.0290.275±0.021 1000.161±0.0260.246±0.028 1 0000.153±0.0190.210±0.022

表5 bFGF对来源于正常皮肤和增生性瘢痕的FB纤维连接蛋白分泌的影响Tab.5 Effect of bFGF on fibronectin secretion by fibroblasts of normal skin and hypertrophic scar μg·mL-1·mg-1,±s

表5 bFGF对来源于正常皮肤和增生性瘢痕的FB纤维连接蛋白分泌的影响Tab.5 Effect of bFGF on fibronectin secretion by fibroblasts of normal skin and hypertrophic scar μg·mL-1·mg-1,±s

与未加入bFGF组比较,*1P＜0.01Compared with fibroblasts untreated by bFGF,*1P＜0.01

bFGF浓度/ (ng·mL-1)正常皮肤FB (纤维连接蛋白) HS的FB (纤维连接蛋白) 0 0.120±0.0180.190±0.020 0.10.140±0.0190.170±0.018 1 0.180±0.0180.160±0.016 100.230±0.0200.190±0.018 1000.340±0.031*10.185±0.019 1 0000.310±0.025*10.178±0.015

3 讨论

皮肤损伤修复与成纤维细胞增殖以及胶原形成密切相关,而过多的成纤维细胞增殖和细胞外基质形成则会形成瘢痕[5]。在此过程中,许多细胞因子参与其中,已有研究证明bFGF对于创伤修复以及瘢痕形成具有积极的作用[6],但其具体分子机制还不清楚。在本研究中,笔者确定bFGF对来源于正常皮肤和HS的FB增殖、胶原和纤维连接蛋白表达合成的影响作用。

在体内实验中,给予bFGF治疗能够明显抑制FB分化以及成纤维细胞的过多形成[4];ONO等[7]则发现,在创伤修复早期(4～7 d)因细胞增殖超过了细胞凋亡数量,故而bFGF可诱导肉芽组织形成,创伤修复后期(14 d)由于细胞凋亡增加而使肉芽组织生长被抑制。本实验中,将来源于正常皮肤和HS的FB置于含有不用浓度bFGF的培养液中培养,通过检测这两种细胞的增殖和凋亡发现,bFGF在一定浓度时促进FB增殖,达到一定程度时抑制FB增殖,促进其凋亡,且HS FB的增殖比来源于正常皮肤的FB更缓慢。

图1 bFGF对来源于正常皮肤和HS的FBⅠ型、Ⅲ型胶原和纤维连接蛋白基因表达的影响Fig.1 Effect of bFGF on gene expression of typeⅠ/Ⅲcollagen and fibronectin in fibroblasts of normal skin and hypertrophic scar

本研究发现,HS FB比正常皮肤来源的FB产生Ⅰ型胶原多[8],而Ⅰ型胶原可以被大剂量bFGF明显抑制。此研究结果与CHOI等[9]的研究一致,bFGF的抑制作用与其下调Ⅰ型胶原的表达关系密切。另外,既往研究发现,在创伤修复早期,Ⅲ型胶原比例上升,本实验发现bFGF对两种来源的FBⅢ型胶原的合成都没有影响[10]。已有学者研究证实,在创伤修复的早期,纤维连接蛋白的表达被上调,是组成临时支架的一部分,也会促进FB迁移,而过多的纤维连接蛋白沉积可能促进HS的形成[11]。本实验结果显示,bFGF上调了来源于正常皮肤FB的纤维连接蛋白基因的表达,促进了其蛋白的产生,而对在HF FB中表达无影响。

本研究结果表明,bFGF既可以抑制来源于HS FB的Ⅰ型胶原的表达合成,也可以促进来源于正常皮肤FB的纤维连接蛋白的表达,这说明bFGF在早期创伤修复以及瘢痕形成过程的作用机制。本研究为bFGF在临床上治疗及预防增生性瘢痕提供了实验基础。

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DOI 10.3870/yydb.2014.11.004

Effects of Basic Fibroblast Growth Factor on Proliferation as well as Collagen and Fibronectin Expression on Fibroblasts

WU Yan1,YANG Lan2,ZHANG Yu-fei1,YUAN Xiao-huan1,CHU Yan-hui1
(1.Medical Research Center, Mudanjiang Medical College,Mudanjiang 157011,China;2.Department of Ophtalmology,Hongqi Hospital, Mudanjiang Medical College,Mudanjiang 157011,China)

ObjectiveTo explore the mechanism and effects of basic fibroblast growth factor(bFGF)on skin wound healing.MethodsFibroblasts(FB)were isolated from normal skin and hypertrophic scar and cultivated by direct adherence method.FB were then treated with different concentrations of bFGF(0,0.1,1,10,100,1 000 ng·mL-1)and cultivated with serum-free medium for 72 hours.The proliferation and apoptosis of FB in each group were detected by cell counting and trypan blue staining.Content and gene expression of typeⅠand typeⅢcollagen and fibronectin were determined by ELISA and RTPCR,respectively.ResultsbFGF promoted the proliferation of FB at low concentrations promoted apoptosis of FB at higher concentrations.The proliferation of FB from hypertrophic scar was slower than that from the normal skin.bFGF significantly inhibited typeⅠcollagen production from hypertrophic scar FB but not from the normal skin.Moreover,bFGF up-regulated fibronectin expression in the normal fibroblasts,but not in the hypertrophic scar.No change in typeⅢcollagen expression and production was observed in FB from either source.ConclusionbFGF has differential effects and mechanisms on FB of the normal skin and hypertrophic scar,suggesting that bFGF may play a role in early phase of skin wound healing and scar formation.

Basic fibroblast growth factor;Fibroblast;Hypertrophic scar;Wound healing

R982;R965

A

1004-0781(2014)11-1416-04

2013-11-05

2013-12-10

*2014年黑龙江省教育厅青年学术骨干支持计划项目(1254G064)

武艳(1982-),女,黑龙江牡丹江人,讲师,博士,研究方向:组织损伤与修复。电话:0453-6984647,E-mail:wuyannini@126.com。

初彦辉(1964-),男,黑龙江牡丹江人,教授,博士,研究方向:组织工程。电话:0453-6984623,E-mail:yanhui_ chu@sina.com。