韩新会 （山东滨州沃华生物工程有限公司 256606）

IBD毒株的卵黄培养方法研究

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本研究表明，IBD毒株首次分离以鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)接种为首选，卵黄囊接种次之。本试验将经CAM驯化的鸡胚适应毒转卵黄囊(Yolk sac)驯化培养，培养结果显示卵黄囊接种的方法，CAM、胚体及尿囊液混合物中的病毒含量高于CAM接种方法的病毒含量，提示该接种方法可用于规模化培养。

IBDV毒株 卵黄培养 病毒含量 产量

鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)能在鸡胚上生长增殖，Hitchner[1]证明9～11日龄鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)是分离病毒最敏感的接种途径，感染的鸡胚通常在3～5日内出现死亡，鸡胚CAM增厚或出现痘斑、腹部水肿、肝坏死、脾肿大及心脏鱼肉样病变。IBDV也可以适应尿囊腔和卵黄囊(Yolk sac)接种。初次分离以CAM接种为首选，卵黄囊接种次之，尿囊腔接种为最差，感染的鸡胚以CAM和肝含毒量最高，尿囊液最低[2]。实际生产中，尽管CAM的病毒含量比较高，但由于产量低并且接种CAM方法操作麻烦，不利于扩大生产。因此，找到一种既方便操作又能提高产量的鸡胚培养方式，是生产实践中急需解决的问题。

通过临床症状和病理剖检结合实验室方法[3]确诊并顺利分离到一株IBDV野毒株，在培养过程中发现感染死亡的鸡胚胚体出血肿大，肝肿大坏死外，还发现卵黄囊也发生病变如出血等。通过卵黄囊接种，收取死亡鸡胚的CAM、胚体、尿囊液的混合物，然后与CAM进行病毒含量的比较，试验表明该方法得到的IBDV病毒含量不低于CAM，而产量却明显提升，所以该方法有一定的可行性，值得推广尝试。

1 材料与方法

1.1 材料

鸡传染性法氏囊病野毒株，2008年分离鉴定[3]获得；SPF鸡胚(购自山东省无特定病原鸡试验种鸡场)；电热恒温培养箱(黄石恒丰医疗器械有限公司)；旋涡混合器(太仓市科教器材厂)；DS-1组织捣碎机(江苏金伟仪器厂)；生物安全柜(北京东联哈尔仪器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 IBDV野毒株的培养及病毒含量测定 选择11日龄发育正常SPF鸡胚，在鸡胚侧壁打孔做人工气室，将IBDV病料取出融化，4000r/min离心15min，取上清过滤，接种鸡胚CAM，每枚0.2ml，共接种10枚，37℃培养。接种后24h、48h内照胚1次/d，去掉死亡鸡胚，以后照胚2次/d，连续观察至120h，将死胚放4℃保存，详细记录鸡胚死亡时间，最后集中无菌收取所有死亡鸡胚的CAM，冻融3次后标记C1代，置-20℃保存。将保存的C1代CAM冻融2次后，取出研碎，接种鸡胚CAM进行C2代的培养，最后收取死亡鸡胚的CAM冻融保存。以同样方式进行C3、C4、……传代培养。

将每代收获CAM作10倍系列稀释，取连续5个稀释度接种鸡胚CAM，每个稀释度接种5枚鸡胚，每枚接种0.2ml，37℃继续培养，接种后连续照胚144h，弃去48h内死亡鸡胚，记录48～144h内死亡鸡胚的数量，根据Eeed-Muench计算方法计算每代的半数致死量。

1.2.2 IBDV的卵黄囊接种培养及病毒含量测定 将经CAM接种稳定的IBDV接种7日龄发育正常SPF鸡胚卵黄囊，每枚鸡胚接种0.2ml，共接种10枚，每天照胚，连续观察至接种后120h，收获接种后48～120h内死亡鸡胚的CAM、胚体、卵黄以及尿囊液，记录为Y1，置－20℃保存。将Y1冻融2次后取出，离心取上清接种鸡胚卵黄囊，进行Y2代培养，收获死亡鸡胚CAM、胚体、卵黄以及尿囊液，如此进行Y2、Y3、……的传代。依照1.2.1检测方法进行Y1、Y2、Y3……病毒含量的测定。

2 结果

2.1 IBDV鸡胚CAM培养结果及病毒含量

CAM接种，鸡胚死亡时间比较集中，主要集中在接种后72～96h之间，死亡鸡胚的CAM增厚，有时可见痘斑；胚体较正常鸡胚小，并且水肿出血；鸡胚卵黄囊出血；剖检鸡胚可见肝脏肿大，有白色坏死灶；脾肿大，布满白色坏死灶，整体红白相间；肺充血於血，肾肿大出血、充血。病毒含量测定结果如表1：

表1 鸡胚半数致死量(ELD50)测定结果

2.2 IBDV鸡胚卵黄囊培养结果及病毒含量

将C4代作为鸡胚卵黄囊接种的种毒接种鸡胚卵黄囊，鸡胚死亡时间集中在接种后60～96h，死亡鸡胚胚体水肿出血，较正常鸡胚小，卵黄囊出血，肝肿大出血。病毒含量测定结果如表2：

表2 鸡胚半数致死量(ELD50)测定结果(枚)

2.3 不同接种方式病毒含量比较

从表中可以看出卵黄囊接种所收获混合物病毒含量与CAM接种所收获病毒含量区别不大，在同一代次下，二者并无统计学意义的差异，而仅收获CAM的数量却远低于收获的卵黄囊、CAM、胚体与尿囊液混合物体积。

表3 病毒含量结果比较

3 讨论

IBDV野毒株比较容易适应鸡胚CAM，成为鸡胚适应毒，在本实验中，IBDV野毒株在鸡胚CAM培养至第四代达到了稳定状态，并且死亡时间集中，病变典型，证明该IBDV野毒株能够很快适应鸡胚CAM培养。IBDV也比较容易适应鸡胚卵黄囊，而且卵黄中病毒含量较高，将此鸡胚适应毒由CAM接种转化为卵黄囊接种，该毒能够顺利实现由CAM培养向卵黄囊培养的转化，并且能够保持在稳定状态，同时得到的卵黄囊、CAM、胚体及尿囊液混合物病毒含量不低于鸡胚CAM的病毒含量，张春杰等人[4、5]也曾证明经卵黄囊接种驯化后的鸡胚适应毒，在卵黄囊内可以达到较高的水平，由此将鸡胚CAM接种方式转为卵黄囊接种方式，更有利于扩大生产规模。另外，鸡胚卵黄囊接种方式，使病毒的收获量得到了很大的提高，同时由于鸡胚接种日龄提前，减少了鸡胚的培养时间，节约了生产成本，具有推广优势。

IBDV的初次分离以CAM接种为首选，卵黄囊接种次之，说明鸡胚卵黄囊接种培养不失为一种分离培养IBDV的方式，而且在本试验过程中证明卵黄囊接种的鸡胚胚体、尿囊液以及CAM混合物病毒含量不低于CAM，进一步说明采用鸡胚卵黄囊培养具有一定生产实践意义，但是IBDV鸡胚培养收获中卵黄容易液化混入尿囊液中，由于卵黄的成分复杂，对病毒的免疫原性以及制备疫苗是否有影响有待于作进一步试验研究。

[1] Hitchner, S. B. 1970. Infectivity of infectious bursal disease virus for embryonating eggs[M]. Poult Sci 49: 611-613.

[2] 殷震, 刘景华. 动物病毒学[M]. 北京: 科学出版社，1997.

[3] 世界动物卫生组织著. 农业部畜牧兽医局译. 哺乳动物、禽、蜜蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册[M]. 北京: 中国农业科学技术出版社, 2002: 606-615.

[4] 张春杰, 程相朝, 郑祥海. 不同途径搁鸡胚培养传染性法氏囊病病毒的比较研究[J]. 中国兽医科技, 1996, 26(4): 25-27.

[5] 张春杰, 陈树光, 郑祥海. 鸡传染性法氏囊病毒鸡胚适应株的培育[J]. 河南畜牧兽医, 1998, 19(1): 24-26.

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