魏开鹏，潘兴南，魏梅娟，张小曼，许正锯

（中国人民解放军第180医院肝病中心，福建 泉州 362000）

异基因人骨髓间充质干细胞与外周血单个核细胞体外共培养的相互影响

魏开鹏，潘兴南，魏梅娟，张小曼，许正锯

（中国人民解放军第180医院肝病中心，福建 泉州 362000）

目的探讨异基因骨髓间充质干细胞(BMSC)与外周血单个核细胞（PBMC）在体外共培养的相互影响。方法将异基因成人来源的BMSC与PBMC在体外分别按1：10混合共培养，采用氚胸腺嘧啶核甙掺入方法检测PHA刺激PBMC增殖的活性，采用ELISA方法检测培养液中分泌的IL-6、IL-8和PGE2水平。结果BMSC与PBMC共培养组的PBMC增殖率明显减少(P＜0.01)，抑制率均超过50%。加入PBMC共培养后，BMSC分泌IL-6、IL-8和PGE2显著增加(P＜0.01)。结论BMSC可以抑制PHA刺激引起的PBMC增殖，PBMC可以促进BMSC分泌免疫活性因子，BMSC可能具有双向的免疫调控作用。

骨髓间充质干细胞；外周血单个核细胞；共培养

骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)是一群骨髓来源的具有自我更新和多向分化潜能的间充质干细胞[1]。BMSC由于获取方便、容易扩增以及良好的伦理适应性而在细胞移植治疗方面备受关注[2]。后来发现除了具备干细胞的基本属性，BMSC还具有独特的免疫调节作用[3]。动物研究和临床试验显示，BMSC输注可以延长异基因移植物的存活时间，移植物抗宿主病(GVHD)的发生率显著降低[4]。本研究通过探讨BMSC与外周血单个核细胞(mononuclear cell，PBMC)在体外共培养的相互影响，为认知BMSC的免疫学作用提供体外实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料BMSC来源于3个健康成人志愿者的骨髓，PBMC来源于另外1个健康成人的外周静脉血，这些供者之间没有同源关系，与供者均签署《知情同意书》。LG-DMEM培养液、胎牛血清、成骨细胞诱导试剂盒、软骨细胞诱导试剂盒和脂肪细胞诱导试剂盒均购自美国Life公司。Ficoll分离液购自美国GE公司。FITC标记的抗人CD14、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105及抗鼠IgG1-κ单抗均购自美国Biolegend公司。检测IL-6、IL-8和PGE2的ELISA试剂盒购自美国R&D System公司。

1.2 BMSC的分离和鉴定按照本课题组之前所报道的方法[5]，从成人骨髓分离BMSC，并从形态、表型和诱导分化三个方面进行综合鉴定。将收获的第3代BMSC分装冻存到液氮备用。

1.3 PBMC的分离采集人外周静脉血等量稀释后沿离心管壁缓慢加到Ficoll分离液上面，注意不要破坏界面，250 g离心30 min后吸弃上层液体，收获白膜状的细胞层即PBMC。将PBMC分装冻存到液氮备用。

1.4 PHA刺激PBMC增殖试验BMSC按2× 104个/ml密度接种入96孔板，每孔100µl设3个复孔。培养2 h贴壁后加入异基因的PBMC(2×105个/ml，100µl)，并添加PHA(2.5µg/ml)。BMSC与PBMC按1:10混合进行共培养，设置未添加PHA的孔作为对照。在孵箱中持续培养72 h，结束前4 h添加氚胸腺嘧啶核甙(3H-TdR)。培养结束收获细胞用液闪计数器计数，以每分钟液闪计数(CPM)表示增殖活性。

1.5 ELISA检测分泌细胞因子将异基因的BMSC和PBMC按1:10混合共培养24 h(如上所述)，收集细胞培养上清液，采用ELISA方法检测IL-6、IL-8和PGE2的水平。操作按试剂盒说明书进行，分别检测单独培养的BMSC、PBMC作为对照。

1.6 统计学方法应用SPSS16.0软件进行统计学分析。定量数据以均数±标准差±s)表示，两组数据间的比较采用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSC的鉴定我们分离到的BMSC具有以下几个特征：(1)黏附塑料培养瓶底面生长，呈长梭状的成纤维细胞样形态并行排列(图1A-a，b，c)；(2)高表达CD73、CD90和CD105，低表达或不表达CD14、CD34和CD45等表面分子(图1B)；(3)在特定条件下培养21 d后，它们可被诱导分化成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞(图1A-d，e，f)。以上特征符合国际干细胞治疗协会(ISCT)提出的鉴定标准[6]。

图1 BMSC的鉴定

2.2 BMSC对PHA刺激PBMC增殖的影响我们将异基因的3个成人的BMSC和另外1个成人的PBMC在体外分别进行共培养，并添加PHA进行刺激。我们发现BMSC与PBMC共培养的组中，PHA刺激引起的PBMC增殖明显减少(P＜0.01)，各组加入BMSC共培养后的增殖抑制率均超过50%(表1)。以上说明，BMSC对PHA刺激引起的PBMC增殖具有明显抑制作用。

表1 各组PHA刺激PBMC增殖活性的比较(±s)

表1 各组PHA刺激PBMC增殖活性的比较(±s)

注：3个组的BMSC分别来自3个异基因供者，PBMC来自另外1个异基因供者；用每分钟液闪计数(CPM)表示增殖活性，实验重复3次；单独PBMC或BMSC培养组的CPM均小于1 000。

组别1 2 3 PBMC+PHA 28057±2903 28057±2903 28057±2903 PBMC+PHA+BMSC 11263±2205 13725±2737 10924±2066抑制率(%) 59.86 51.08 61.06 t值7.98 6.22 8.33 P值＜0.01＜0.01＜0.01

2.3 PBMC对BMSC分泌细胞因子的影响我们在体外培养过程中检测可溶性细胞因子的分泌量，BMSC单独培养可以分泌IL-6、IL-8和PGE2等免疫活性细胞因子，PBMC单独培养可以检测到少量IL-6和IL-8。当我们将异基因的BMSC与PBMC按1：10比例进行共培养后，IL-6、IL-8和PGE2的分泌量均显著增加(P＜0.01)，其中PGE2的分泌量增加幅度最大(图2)。

图2 PBMC对BMSC分泌细胞因子的影响

3 讨论

BMSC作为比较原始的基质细胞与基质细胞和内皮细胞等参与构成造血微环境，其表型和功能与胸腺基质细胞相似提示BMSC可能在免疫调节方面有一定的作用[7]。BMSC不表达MHC-Ⅱ类分子和FasL，也不表达CD80、CD86和CD40等共刺激分子[8]。体外实验证实，将BMSC与异基因外周血PBMC或同种异体T细胞共培养并不引起T细胞的活化增殖[9]。PHA作为一种有丝分裂原可以强烈刺激T细胞活化增殖，但本研究发现添加BMSC共培养后PHA刺激引起的PBMC增殖受到明显的抑制，说明BMSC除了具有较低的免疫原性和抗原提呈能力，还可以发挥免疫抑制作用。

BMSC具有基质细胞的特性，能够分泌多种可溶性细胞因子[10]。PGE2不仅可以抑制B细胞介导的体液免疫，也可以抑制T细胞介导的细胞免疫，在体内作为一种重要的负向调节因子维持免疫平衡[11]。我们发现，BMSC体外培养时自身可以分泌少量的PGE2。当与异基因的PBMC混合培养时，BMSC分泌的PGE2急剧增加，这提示PGE2作为一种免疫抑制因子可能在之前观察到的免疫抑制现象的机制中扮演重要角色。

IL-6促进B细胞和T细胞活化参与炎症反应，IL-8作为一种趋化因子对炎症效应细胞具有强烈的趋化作用[12]。我们发现BMSC体外培养时自身也可以分泌少量的IL-6和IL-8。当与同种异体的PBMC混合培养时，这两种免疫促进因子也明显升高，这提示BMSC不仅可以分泌细胞因子介导免疫抑制作用，也可以分泌细胞因子促进免疫应答。因此，BMSC在不同的微环境调控下可能具有双向的免疫调节作用。

综上所述，BMSC在体外可以抑制PHA刺激引起的PBMC增殖，PBMC可以促进BMSC上调PGE2等免疫抑制因子的分泌，也可以促进BMSC上调IL-6和IL-8等促炎因子的分泌。目前对BMSC与免疫系统的关系并不十分清楚，BMSC可能通过多种途径与免疫细胞互动发挥双向免疫调控作用，其具体细节和机制有待进一步的研究。

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Interactions of allogeneic human bone marrow mesenchymal stem cell and peripheral blood mononuclear cell cocultured in vitro.

WEI Kai-peng,PAN Xing-nan,WEI Mei-juan,ZHANG Xiao-man,XU Zheng-ju.
Center of Liver

Disease,the 180thHospital of PLA,Quanzhou 362000,Fujian,CHINA

ObjectiveTo explore the interaction of allogeneic human bone marrow mesenchymal stem cell (BMSC)and peripheral blood mononuclear cell(PBMC)cocultured in vitro.MethodsHuman BMSC and PBMC isolated from unrelated donors were cocultured(BMSC to PBMC ratio,1:10).3H-TdR incorporation test were used to evaluate PHA-induced proliferation.ELISA test was used to determine the levels of IL-6,IL-8 and PGE2 in cell culture supernatant.ResultsThe presence of BMSC resulted in a statistically significant(P＜0.01)decrease in PHA-induced proliferation in PBMC and the inhibition rate was more than 50%.The levels of IL-6,IL-8 and PGE2 significantly(P＜0.01)increased when PBMC were added to BMSC.ConclusionBMSC can mediate suppression of PHA-induced PBMC proliferation.PBMC can promote BMSC to secrete positive and negative immune factors.BMSC may have dual effects on immune reactions.

Bone marrow mesenchymal stem cell(BMSC);Peripheral blood mononuclear cell(PBMC);Coculture

R329.2+8

A

1003—6350（2014）17—2507—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.17.0982

2014-03-25)

泉州市社会发展计划重点项目（编号：2012Z60）

魏开鹏。E-mail：kpweicn@163.com