孙王伟，周燕菊，谢怡萍，沙霞，王建军

（昆山市第一人民医院检验科，江苏昆山 215300）

·论著·

PCR 直接测序法在脓肿分枝杆菌鉴定中的应用

孙王伟，周燕菊，谢怡萍，沙霞，王建军

（昆山市第一人民医院检验科，江苏昆山 215300）

目的探讨聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)与DNA测序技术鉴定脓肿分枝杆菌的效果。方法利用细菌16S rRNA基因通用引物PCR扩增疑似分枝杆菌的16S rRNA基因的DNA片段并进行DNA测序分析。DNA测序获得序列经生物信息学比对分析获得相关分枝杆菌的信息；针对相关分枝杆菌分别设计非同源区域特异性引物对1 500 bp的克隆DNA片段扩增验证。结果细菌16S rRNA基因通用引物扩增获得约1 500 bp的DNA片段，但DNA测序仅获得其中部分DNA序列约296 bp；部分DNA序列经生物信息学比对分析后获得四种同源性高达98%的分枝杆菌信息，并且四种分枝杆菌的特异性引物对1 500 bp的克隆产物进行扩增后仅在脓肿分枝杆菌中获得特异性PCR产物。结论疑似结核患者体内的抗酸染色阳性菌为非结核分枝杆菌中的脓肿结核分枝杆菌，并且PCR直接测序法可快速鉴定细菌的种属。

聚合酶链式反应；DNA测序；16S rRNA；生物信息学；脓肿分枝杆菌

非结核分枝杆菌(Non-Tuberculous mycobacteria，NTM)是结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌，而脓肿结核分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)属于其中IV群的快生长菌[1]。近年来NTM在我国引发了多起院内感染，大多由于手术器械被污染、创口污染等导致暴发，而目前尚无特异高效的抗NTM药物且NTM病治疗较为棘手并且预后不佳[2]。脓肿分枝杆菌主要可导致患者肺部与皮肤感染，以咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、肉芽肿等症状为主。脓肿分枝杆菌对临床上常用的大多数抗结核药物均有耐药性，且治疗过程长而差，因此临床快速、准确的鉴定菌种及药敏情况分析，对疾病的治疗具有关键作用[3]。PCR是一种以核酸生物化学为基础的分子生物学诊断技术，在生物医学领域最有应用价值，对结核分枝杆菌的诊断、菌种类型的鉴定有较高的灵敏度和特异性。本研究采用PCR-直接测序鉴定法，利用细菌16S rRNA基因的通用引物对分枝标本进行扩增，获得产物后直接DNA测序，生物信息学分析确定分枝杆菌的种类。

1 材料与方法

1.1 研究对象久治不愈疑似结核患者的痰标本。

1.2 主要试剂正常熔点琼脂糖、低熔点琼脂糖和碘化丙啶购于Sigma公司(美国)，抗酸染色试剂、罗氏培养基和基因组DNA提取试剂购自碧云天公司，DNA聚合酶购自Takara公司。

1.3 抗酸染色取少量痰标本高压蒸汽灭菌后涂片，石炭酸复红初染1 min，3%盐酸酒精脱色1 min，碱性美兰复染1 min，细水冲洗后自然晾干，高倍镜观察并拍照保存。

1.4 基因组DNA提取1 ml痰标本中加入3倍体积的4%NaOH，震荡混匀20 s，放置15 min，7 800×g离心10 min，去上清，加入生理盐水1 ml，混匀，7 800×g离心10 min，去上清液；加入100 μl DNA提取液，100℃加热10 min，迅速冷却(置于-20℃冰箱)10 min，7 800×g离心2 min，0.5%琼脂糖凝胶电泳分析，其余-80℃保存备用。

1.5 引物序列根据NCBI数据库检索以下基因的cDNA序列Premier 5软件设计引物并合成，见表1。

表1 设计合成的引物序列

1.6 16S rDNA PCR50 μ l PCR体系中含cDNA 5 μl，rTaqDNA聚合酶2.0 μl，10 mmol/L上游引物1 μl，10 mmol/L下游引物1 μl，2.5 mmol/L dNTPs 4 μl，无核糖核酸酶水32 μl，10×PCR缓冲液5 μl；95℃预变性7 min，94℃变性1 min，62℃退火1 min，72℃延伸1 min，72℃终延伸10 min，共30个循环，1.0%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。

1.7 生物信息学分析PCR产物送北京鼎国昌盛生物技术公司测序，将获得的DNA序列在NCBI数据库中进行BlastN分析比对，获得四种同源度高达98%的分枝杆菌。利用Primer 5软件在四种分枝杆菌的非同源区域设计并合成特异性引物，对16S rDNA的PCR产物进行PCR扩增验证。

1.8 四种特异性引物PCR50 μl PCR体系中含模板DNA 5 μl，TaqDNA聚合酶1.0 μl，10 mmol/L上游引物1μl，10 mmol/L下游引物1μl，2.5 mmol/L dNTPs 4 μl，无核糖核酸酶水33 μl，10×PCR缓冲液5 μl；94℃预变性2 min，94℃变性30 s，54℃退火35 s，72℃延伸35 s，72℃终延伸5 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。

2 结果

2.1 抗酸染色取适量高压蒸汽灭菌后的痰液抗酸染色，高倍镜下寻找观察抗酸染色菌，见图1。

图1 痰液抗酸染色结果(×1 000)

2.2 基因组DNA提取高压蒸汽灭菌后的痰液，根据MTB DNA检测试剂盒方法-煮沸裂解法提取抗酸分枝杆菌基因组DNA，1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，见图2。

图2 抗酸分枝杆菌基因组DNA电泳结果

2.3 16S rDNA PCR扩增以抗酸分枝杆菌基因组DNA为模板，16S rDNA细菌通用基因引物PCR扩增特异性片段并1.5%琼脂凝胶电泳分析，见图3。

2.4 PCR产物测序结果细菌16S rDNA通用引物PCR扩增获得的产物，纯化浓缩后送北京鼎国昌盛生物技术公司多次测序，仅获得296 bp的DNA序列：

TGCAGTCGACGGAAGGCCTTCGGGGTACTCGA GTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATC TGCCCTGCACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTG GGTCTAATACCGGATAGGACCACACACTTCATG GTGAGTGGTGGTGCAAAGCTTTTGGTGTGGGA GGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCAC ACTGGGACTGAAATACGGTCCATACTCCCTAC GGGAGGCAGCAGTGAGG

图316 S rDNA引物PCR产物电泳结果

2.5 生物信息学分析测序获得的296 bp DNA序列在NCBI数据库（http://ncbi.nlm.nih.gov/ nucleotide）BlastN软件中与微生物核酸数据库进行比对分析获得如下结果，见图4。

图4 296 bp DNA测序序列在NCBI数据库blastn结果

2.6 四种特异引物验证针对与测序获得的四种高达98%的同源序列的非同源区域分别设计特异性引物，利用该四种引物对细菌16S rDNA通用引物的PCR产物再次进行PCR扩增，见图5。

图5 四种特异性引物PCR产物电泳结果

3 讨论

传统的分枝杆菌生化鉴定耗时且准确性差。近年来，PCR和DNA碱基序列测定技术得到迅速发展，这两种技术的结合为细菌的分类与鉴定提供了一种快速、准确的方法[4]。16S rRNA基因被称为细菌的活化石，为高度保守基因，其进化速度十分缓慢，据测算1%碱基的取代需要大约50×106年，因而使其具有生物钟的特点，16S rRNA基因序列具有细菌属、种的特征，因而16S rRNA基因测序已作为细菌分类和鉴定的金标准[5]。目前已知分枝杆菌的16S rRNA基因已经全部测序。通过基因比较分析，发现分枝杆菌16S rRNA基因既含有属特异的保守序列，又含有种特异性的高变区。以16S rRNA基因为靶基因，采用PCR-测序方法，通过序列的分析可以鉴定病原菌[6]。目前16SrRNA商品试剂盒可以成功扩增出人结核分枝杆菌的序列，但应用在非结核分枝杆菌中较少，本研究中用16S rRNA基因的通用引物PCR扩增疑似结核病人痰标本，获得一段1 500 bp的产物，经DNA测序仅获得部分DNA序列，然而多次重复实验测序仅获得296 bp的DNA序列，存在以下几种可能：(1) 16S rRNA虽然是微生物基因组的通用序列，但不一定适合每一种微生物基因组片段的扩增如脓肿分枝杆菌；(2)在测序过程出现某些问题导致未能测出全长序列。一般情况下，16S rRNA基因的通用引物PCR扩增获得的产物经测序可获得全部的DNA序列，经生物信息学分析可以获得该菌种的信息，从而确定细菌的属、种。本研究中296 bp的DNA序列经生物信息学比对分析获得了四种同源性高达98%的分枝杆菌，但无法具体确定患者的分枝杆菌到底是哪一种。因此，针对该四种序列与296 bp DNA序列的非同源序列设计了四种特异性引物，利用四种引物对16S rRNA扩增获得的产物重新进行PCR扩增，若获得产物即说明296 bp DNA序列为四种分枝杆菌序列中的一种，也就可以确定该分枝杆菌为哪种分枝杆菌。最终，脓肿分枝杆菌特异性引物在长度为1 500 bp的PCR产物中扩增出了250 bp左右的特异性条带。从而确定了该结核患者体内的病原菌为脓肿分枝杆菌。

PCR和测序可以在1～2 d完成，而常规临床分枝杆菌分离株的鉴定需要1个月时间，因此基因扩增与测序技术鉴定分枝杆菌可以大大节约时间，使患者得到及时正确的治疗。

[1]赵建宏,李雅静,温海楠,等.非结核分枝杆菌感染的分子诊断研究进展[J].检验医学,2012,3(11):155-158.

[2]Wu TS,Lu CC,Lai HC.Current situations off identification of nontuberculous mycobacteria[J].J Biomed Lab Sci,2009,21(1):1-5.

[3]马小波,梁朝霞,徐庆雷,等.11例非结核分枝杆菌耐药性分析[J].检验医学与临床,2010,24(7):2748-2749.

[4]Ngan GJ,Ng LM,Jureen R,et a1.Development of multiplex PCR assays based on the 16S-23S rDNA internal transcribed spacer for the detection of clinically relevant nontuberculous mycobacteria[J]. LettAppl Microbiol,2011,52(5):546-554.

[5]Khan IU,Selvaraju SB,Yadav JS.Method for rapid identification and differentiation of the species of the Mycobacterium chelonae rRNA geneinternalrestrictionanalysiscomplexbasedon 16S-23S transcribed spacer PCR[J].J Clin Microbiol,2005,43(9): 4466-4472.

[6]彭涛,温博海,蹇锐.分支杆菌临床分离株的16S rDNA基因序列分析[J].中国人兽共患病杂志,2004,20(9):772-776.

Application of PCR and direct sequencing technologies in the identification of Mycobacterium abscessus.

SUN Wang-wei,ZHOU Yan-ju,XIE Yi-ping,SHA Xia,WANG Jian-jun.
Department of Laboratory,the First People's Hospital of Kunshan,Kunshan 215300,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo explore the identification of Mycobacterium abscessus with PCR,direct sequencing approaches and bioinformatics.MethodsDNA fragments of 16S rRNA gene were acquired using PCR and DNA sequence obtained by DNA sequencing.DNA about Mycobacterium was analyzed by bioinformatics.Specific primers of non-homologous region for relevant branches Bacillus were designed respectively to clone DNA fragment of 1 500 bp product.ResultsDNA fragment of 1 500 bp was acquired with PCR,but only a part of the DNA sequence of approximately 296 bp was obtained.After DNA sequence bioinformatics analysis,four kind of Mycobacterium with homology of up to 98%were obtained.Finally,we only obtained PCR special product in M.abscessus when four kinds of spe-cific primers for Mycobacterium were used to clone the DNA fragment of 1 500 bp.ConclusionThe Mycobacterium in the suspected TB patients is M.abscessus,and species of bacteria can be identified rapidly by PCR and direct sequencing approaches.

Polymerase chain reaction;DNA sequencing;16S rDNA;Bioinformatics;Mycobacterium abscessus

R378.91

A

1003—6350（2014）22—3342—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.22.1308

2014-04-23)

昆山市科技计划项目（编号：KS1347）

王建军。E-mail：wangjianjun0520@163.com