刘锋，郑玲霞，徐兵，周红升

(1.中国人民解放军第171医院血液科，江西九江 332000；2.南方医科大学南方医院血液科，广东广州 510515)

丙泊酚联合氯胺酮麻醉对急性淋巴细胞白血病患儿外周血T淋巴细胞免疫功能的影响

刘锋1，郑玲霞1，徐兵2，周红升2

(1.中国人民解放军第171医院血液科，江西九江 332000；2.南方医科大学南方医院血液科，广东广州 510515)

目的观察丙泊酚联合氯胺酮麻醉对急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿外周血T淋巴细胞免疫功能的影响。方法对照组为80例健康体检儿童，试验组为78例经骨髓穿刺确诊为ALL的患儿，试验组患儿鞘内注射化疗药物治疗，期间静脉注射丙泊酚[(2±1)mg/kg]联合氯胺酮(0.5 mg/kg)镇静麻醉，分别将经骨髓穿刺确诊镇静麻醉前、镇静麻醉6 h后（即鞘内注射前）及镇静麻醉24 h后(即鞘内注射并镇静麻醉18 h后)的患儿血样设为TG-t0组、TG-t1组和TG-t2组。采用流式细胞仪对外周血T淋巴细胞亚群：CD3、CD4、CD8和CD4/CD8的水平和CD4+CD25+CD127-Treg细胞进行检测。以Ag-NORs、Th1/Th2比值及TGF-β作为免疫学指标，采用KL型肿瘤免疫图像分析系统对外周血Ag-NORs进行检测；采用酶联免疫吸附法检测Th1/Th2比值及TGF-β的血清浓度水平。结果试验组患儿外周血CD8、Treg比例、TGF-β水平明显高于对照组，而CD3、CD4、CD4/CD8比值、Ag-NORs水平及Th1/Th2比值明显低于对照组，TG-t0组、TG-t1组和TG-t2组的T细胞亚群及相关免疫学指标差异均无统计学意义。结论ALL患儿较健康儿童机体免疫功能低下，而在诊断和术后使用丙泊酚联合氯胺酮麻醉对其外周血T淋巴细胞免疫功能改变无直接影响。

急性淋巴细胞白血病；丙泊酚，氯胺酮；T淋巴细胞；免疫功能；鞘内注射

急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿常伴有细胞免疫功能受损，表现为T细胞亚群比例紊乱和功能受损；具有免疫抑制作用的CD4+CD25+Treg细胞及其与瘤细胞共同分泌的转化生长因子-β(TGF-β)等免疫抑制因子的高表达；辅助T淋巴细胞1型/2型(Th1/ Th2)比例失衡等。ALL目前仍以综合治疗为主，而化疗在其治疗中占有重要地位，采用鞘内注射是目前治疗ALL的一个重要手段。ALL患儿在诊断和化疗过程中常要进行镇静治疗。麻醉和手术可能对ALL患儿的细胞免疫功能有一定影响，研究表明，麻醉药品可能影响实体瘤与癌症细胞增殖[1-2]。本研究旨在探讨丙泊酚联合氯胺酮麻醉对早期ALL患儿诊断和鞘内注射化疗后对其外周血T淋巴细胞免疫功能的影响，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料本研究试验组为2012年1月至2013年6月在解放军第171医院和南方医科大学南方医院住院的78例患儿，经骨髓穿刺确诊为急性淋巴细胞白血病。其中男性44例，女性34例，年龄2～15岁，平均(6.27±3.84)岁。对照组为80例同期来两医院进行健康体检的健康儿童，其中男性42例，女性38例，年龄2～15岁，平均(6.18±3.73)岁。所有病例均符合儿童急性淋巴细胞白血病的诊疗建议标准[3]；均无肿瘤及自身免疫疾病史；3周内均未接种过疫苗；1周内均未进行过手术治疗。

1.2 治疗分组本研究分为试验组和对照组，按照医学伦理学的基本伦理原则，本研究中暂无骨髓穿刺诊断和鞘内注射化疗药物后未经镇静麻醉的对照组，因此试验设计采用自身前后对照[4]以研究丙泊酚联合氯胺酮麻醉对早期ALL患儿诊断和鞘内注射化疗后外周血T淋巴细胞免疫功能的影响，并设对照组以研究早期初诊ALL患儿外周血T淋巴细胞免疫功能的改变。分别将经骨髓穿刺确诊后患儿，经静脉注射丙泊酚[(2±1)mg/kg]联合氯胺酮(0.5 mg/kg)镇静麻醉前、镇静麻醉6 h后(即鞘内注射前)及镇静麻醉24 h后(即鞘内注射并镇静麻醉18 h后)的患儿血样设为TG-t0组、TG-t1组和TG-t2组[4]，如图1所示。

图1 试验组分组方案

1.3 治疗方法鞘内注射化疗药物为0.9%生理盐水(NS)10 ml+甲氨蝶呤(MTX)10 mg+阿糖胞苷(Ara-C)50 mg+地塞米松(DXMS)5 mg，针对MTX耐药或严重头痛等的不良反应者，也可用阿糖胞苷(Ara-C)50 mg代替。对照组儿童在性别、年龄构成上与试验组患儿相匹配。

1.4 主要试剂与材料抗CD3、CD4、CD8单抗及CD4-FITC、CD25-PE、CD127-Alexa Fluro 647单克隆抗体及其同型对照抗体等购自美国BD公司；RPMI-1640培养液购置美国GIBCO公司；小牛血清购自广州蕊特生物科技有限公司；FASC溶血素和流式细胞仪均购自美国BD公司；KL型肿瘤免疫图像分析系统购自北京健尔康医疗设备有限公司；ELISA试剂盒购自美国eBioScience公司。

1.5 T细胞亚群的检测分别采集对照组和试验组儿童空腹下外周血，经肝素抗凝，密度梯度离心法分离得单个核细胞(MNC)，用2 mmol/L的谷氨酰胺和含10%小牛血清的RPMI-1640培养液调成终浓度为1×106/ml后将抗CD3、CD4、CD8单抗加入至100 μl的MNC中，室温避光孵育30 min，PBS洗2次，用500 μl的2%多聚甲醛固定后避光静置30 min，流式细胞仪上机检测。

1.7 免疫学指标的检测

1.7.1 T淋巴细胞核仁组成区嗜银蛋白(Ag-NORs)的检测无菌条件下分别采集对照组和试验组儿童空腹下外周血，肝素抗凝，取抗凝血500 μl加入到含RPMI-1640培养液中37℃下培养72 h后，取10 ml细胞悬液经离心10min后弃去上清液，加入5 ml低渗液混匀后再加入0.5 ml固定液混匀，离心弃上清，重复操作一遍。沉淀中再加入0.3 ml固定液，混匀后取2滴至预冷载玻片上，过火晾干，然后放于预热后的铝板上，去热后加入4滴染液A和2滴染液B，将盖玻片轻放于载玻片上，待其为深黄色时取下，净水洗净后自然晾干，将染片置显微镜载物台上，经KL型肿瘤免疫图像分析系统计数30个淋巴细胞银染核仁区面积与核面积的比值(IS%)。

1.7.2 Th1/Th2及TGF-β的检测采用酶联免疫吸附法(ELISA)，利用定量ELISA试剂盒测定对照组和试验组儿童空腹下外周血血清中Th1/Th2比值(其中INF-γ代表Th1，IL-10代表Th2)和TGF-β的含量(根据试剂盒中样品标准曲线计算)。

1.8 统计学方法采用SPS13.0统计软件对数据进行处理，计量资料以均数±标准差(±s)表示，采用大样本均值间的u检验对对照组和试验组间样本差异进行显著性检验，以配对资料的u检验对TG-t0组、TG-t1组和TG-t2组间样本差异进行显著性检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组与试验组的临床特征比较对照组和试验组(镇静麻醉前初诊患儿)年龄、体重、C反应蛋白、血红蛋白、白细胞数、血小板数等临床特征见表1。与对照组比较，急性淋巴细胞白血病患儿有白细胞数增高伴不同程度的血小板减少等血象特征。

表1 对照组与试验组的临床特征比较(±s)

表1 对照组与试验组的临床特征比较(±s)

注：与对照组比较，aP＜0.01。

组别对照组试验组年龄(岁) 6.18±3.73 6.27±3.84性别比(男/女) 42/38 44/34体重(kg) 24.27±4.17 24.31±3.24血红蛋白(g/L) 113.45±11.04 63.14±12.36a白细胞数(109/L) 7.21±3.15 67.21±68.35a血小板数(109/L) 138.57±16.28 64.51±31.83aC反应蛋白(mg/L) 7.27±2.53 43.58±37.94a原始淋巴细胞+幼稚淋巴细胞(%) 7.13±1.48 57.46±12.71a

2.2 外周血T细胞亚群的变化比较与对照组比较，试验组患儿外周血T细胞亚群明显异常，表现为外周血抑制性T细胞(CD8)明显高于对照组，而总T细胞(CD3)、辅助性T细胞(CD4)及CD4/CD8比值则明显低于对照组。所有患儿TG-t0组、TG-t1组和TG-t2组的CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比值差异均无统计学意义，见表2。

表2 外周血T细胞亚群变化比较(±s)

表2 外周血T细胞亚群变化比较(±s)

注：与对照组比较，aP＜0.05。

项目对照组TG-t0组TG-t1组TG-t2组CD3(%) CD4(%) CD8(%) CD4/CD868.52±3.67 40.71±3.82 25.95±6.84 1.48±0.27 47.53±6.25a26.38±4.97a35.62±7.71a0.74±0.24a47.45±6.31a26.41±4.85a35.15±7.53a0.72±0.18a46.79±6.27a26.12±4.74a35.46±7.17a0.71±0.31a

2.4 免疫学指标的变化比较与对照组比较，试验组患儿血清中Ag-NORs、Th1/Th2比值均明显低于对照组，而血清TGF-β水平均较对照组明显升高。所有患儿血清中Ag-NORs、Th1/Th2比值及TGF-β水平差异均无统计学意义，见表3。

表3 免疫学指标变化比较(±s)

表3 免疫学指标变化比较(±s)

注：与对照组比较，aP＜0.05。

组别TGF-β(ng/ml) Ag-NORs(IS%)Th1/Th2对照组TG-t0组TG-t1组TG-t2组1.06±0.38 1.28±0.47a1.31±0.52a1.30±0.49a8.66±0.78 5.91±0.74a5.87±0.68a5.89±0.72a1.24±0.32 1.08±0.38a1.06±0.34a1.05±0.37a

3 讨论

急性淋巴细胞白血病为一种骨髓恶性细胞恶性克隆性疾病，其前体淋巴细胞增值代替了骨髓的正常造血功能。鞘内注射化疗药物是ALL治疗的重要手段，但长时间手术应激往往会降低患者的免疫功能，导致术后感染和增加病情风险[6]。麻醉能减少术后引起的应激反应，但不同麻醉方法与麻醉药品本身可能会对患者的免疫功能造成影响，一定程度上影响ALL患者的治疗与预后，因此，麻醉对ALL患儿的免疫功能的影响不容忽视。异丙酚为临床上最常使用的静脉全麻药，关于异丙酚对机体免疫功能的影响已进行了大量的研究，认为异丙酚比吸入麻醉药更能保护机体免疫功能[7]。有学者关于异丙酚和异氟醚对手术引起的免疫应答的影响研究表明，异丙酚能更好地减轻手术引起的应激反应[8-9]。氯胺酮为临床常用静脉全麻药，临床亚剂量的氯胺酮具有很强的镇静作用。Beilin等[10]的研究表明，麻醉诱导前静注小剂量氯胺酮，IL-2保持术前水平而IL-6与TNF-α分泌减少，有利于患者围术期免疫调节平衡。然而未见关于丙泊酚联合氯胺酮麻醉对ALL患儿诊断和鞘内注射化疗后是否有细胞免疫功能影响的报道。本文旨在研究急性淋巴细胞白血病患儿外周血T淋巴细胞免疫功能，以了解其免疫状态，并观察诊断和术后使用丙泊酚联合氯胺酮麻醉对其外周血T细胞亚群及细胞免疫功能的影响。

ALL的发生、发展与多种因素有关，当机体免疫功能紊乱或低下时，ALL的发病率增高。T淋巴细胞在肿瘤的发生、发展及其治疗中发挥重要作用，其中CD4+细胞主要为辅助性T细胞(Th)，可分为Th1、Th2、Th17三类效应细胞；而细胞主要由细胞毒性和抑制性T细胞组成。本研究结果表明，试验组患儿外周血T细胞亚群较对照组明显异常，表现为CD8明显高于对照组而CD3、CD4及CD4/CD8比值则明显低于对照组，与已有文献报道一致[11]，而所有患儿在诊断和术后使用丙泊酚联合氯胺酮麻醉对其外周血CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比值影响均差异无统计学意义。

为进一步比较丙泊酚联合氯胺酮麻醉对ALL患儿细胞免疫功能的影响，选择以下指标进行检测[15]：(1)Ag-NORs(2)Th1/Th2比值(3)TGF-β。Ag-NORs为RNA聚合酶亚单位，其表达水平与机体肿瘤生长状况密切相关，可作为肿瘤诊断和病情检测的重要指标，其含量减少表明机体的免疫功能降低。Th1/Th2两类细胞因子平衡失调是导致许多疾病免疫功能低下的基础，Th1细胞选择性产生促炎症因子，如IL-1和INF-γ，而Th2细胞选择性产生抗炎症因子，如IL-4和IL-10，Th1/Th2比值可反映机体抗肿瘤状态，Th1向Th2偏移则导致免疫抑制状态。而TGF-β能反映肿瘤对机体免疫应答的抑制程度。研究表明，试验组患儿的Ag-NORs和Th1/Th2比值较对照组均显著降低，而TGF-β水平显著升高，与文献报道一致[15]。同时所有患儿在诊断和术后使用丙泊酚联合氯胺酮麻醉对其外周血各项免疫学指标影响差异均无统计学意义。

综上所述，细胞免疫紊乱是导致ALL发生与病情发展的重要原因和严重后果，该研究表明ALL患儿机体免疫功能低下，而在诊断和术后使用丙泊酚联合氯胺酮麻醉对其外周血T淋巴细胞免疫功能无直接影响。因而提示，丙泊酚联合氯胺酮麻醉是ALL患儿化疗手术中一种较理想的麻醉方法。

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Effects of propofol combined with ketamin on the changes in immune function of T lymphocytes in peripheral blood from children with acute lymphocytic leukemia.

LIU Feng1,ZHENG Ling-xia1,XU Bing2,ZHOU Hong-sheng2.1.Department of Hematology,the 171stHospital of Chinese PLA,Jiujiang 332000,Jiangxi,CHINA;2. Department of Hematology,Nanfang Hospital of Southern Medical University,Guangzhou 510515,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo explore the effects of propofol combined with ketamin on the changes in immune function of T lymphocytes in peripheral blood from children with acute lymphocytic leukemia(ALL).MethodsA total of 80 healthy children were selected as the control group,while 78 children with ALL diagnosed by bone marrow aspiration were enrolled as the study group.Patients in the study group undergoing lumber puncture with chemotherapeutics received sedation with IV propofol[(2±1)mg/kg]and ketamine(0.5 mg/kg).Blood samples of patients before sedation for bone marrow aspiration was represented as TG-t0,sedation 6 hours after TG-t0(before lumber puncture with chemotherapeutics)was represented as TG-t1,and 24 hours after TG-t0(during lumber puncture with chemotherapeutics sedation 18 hours)was represented as TG-t2.Levels of T lymphocyte subsets and CD4+CD25+CD127-Treg cells were detected by flow cytometry.The ratio of Ag-NORs,Th1/Th2 and TGF-β were used as cellular immune indicators.A KL image system was used to analyze the ratio of Ag-NORs of T lymphocytes,and ELISA assay was employed to investigate the Th1/Th2 and levels of TGF-β in serum.ResultsThe proportion of CD8 cells and Treg cells and levels of TGF-β in serum from patients in the study group were higher than those of the control group.There were no significant differences in the levels of T lymphocyte subsets and cellular immune indicators among group TG-t0, group TG-t1 and group TG-t2.ConclusionChildren withALL have lower immune function,and sedation with propofol-ketamine combination may not affect the immune function of T lymphocytes in peripheral blood directly.

Acute lymphocytic leukemia;Propofol;Ketamin;T lymphocyte;Immune function;Lumber puncture

R733.71

A

1003—6350（2014）05—0693—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.05.0269

2013-08-09)

刘锋。E-mail：liufeng171126@126.com