周琼琼等

摘 要 为探索适用于茶树叶片蛋白质组学研究的双向电泳技术体系（2-DE），比较三氯乙酸（TCA）/丙酮沉淀法和改良酚抽法2种不同总蛋白质提取方法、不同蛋白上样量对2-DE的影响。结果表明：改良酚抽法更适合茶树总蛋白质的提取；采用1.5 mg的蛋白质上样量，最终可获得蛋白质点较多、背景清晰、分辨率较高的双向电泳图谱，为进一步深入开展茶树蛋白质组学的研究奠定了基础。

关键词 茶树；叶片；蛋白质组学；双向电泳

中图分类号 Q949.758.4 文献标识码 A

Establishment of Extraction Methods and

Two-dimensional Electrophoresis Conditions

for Proteomic Analysis of Camellia sinensis

ZHOU Qiongqiong1，SUN Weijiang1，2*

1 College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

2 Anxi Tea College， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract In order to develop efficient two-dimensional electrophoresis（2-DE） conditions suitable for tea proteome analysis， the effects of different protein extraction methods and sample loading amount were compared. The results showed that the modified phenol extraction protocol was more suitable for total protein extraction of tea compared with trichloroacetic acid（TCA）/acetone precipitation. And loading 1.5 mg protein sample， a high quality 2-DE image map with more protein spots， clear background and high protein point resolution was obtained. The research provides a foundation for further study of tea proteomics.

Key words Tea；Leaf；Proteomics；Two-dimensional electrophoresis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.012

蛋白质组学现已成为后基因组学时代的研究热点之一。蛋白质是生物功能的主要执行者和体现者，可更直接地揭示生命活动的本质。通过蛋白质组的分析可了解蛋白质的表达水平、检测生命活动变化过程中蛋白质的表达量及翻译后修饰等的变化，从而阐明生物功能产生的机制[1]。近年来，蛋白质组学技术被广泛应用于生物学研究的各个方面。双向电泳（Two dimensional electrophoresis，2DE）技术自1975年由OFarrell[2]提出，在细菌、动物组织、细胞及植物等全蛋白组分研究方面发挥了巨大作用，与质谱技术、生物信息学称为蛋白质组学研究的3大核心技术[3]。

根据已有的研究结果表明，不同的植物材料由于组织特异性和代谢产物的差异，其双向电泳体系不尽相同，目前尚没有一种适用于所有植物样品的蛋白质样品制备方法和双向电泳技术体系。曾广娟等[4]探索了适用于苹果叶片蛋白质双向电泳样品的制备方法，最终得出Tris-HCl提取蛋白所得图谱背景清晰、蛋白质信息量大；赵芹等[5]采用改良酚抽法提取节瓜蛋白质总量较高，采用17 cm、pH4～7范围IPG胶条、120 μg蛋白质上样量、12%凝胶浓度，硝酸银染色获得蛋白质点数丰富、分辨率高、背景清晰且重复性好的双向电泳图谱；秦利征等[6]建立了适用于水稻根系蛋白质组研究的改良TCA/丙酮/SDS法，且蛋白上样量为350 μg时所获得的双向凝胶图谱清晰、重现性好。由此可见，针对不同植物和组织选取合适的蛋白质样品制备方法及双向电泳技术体系对于试验结果至关重要。

茶树[Camellia sinensis（L.）O. Kuntze]属山茶科山茶属，为多年生常绿木本植物。茶树叶片含有大量的多糖、多酚及色素等次生代谢产物，在研磨时，多酚类物质极易发生氧化，影响蛋白样品的制备及电泳过程[7]，这些因素给茶树蛋白质组学研究的开展增加了难度。本研究在前人研究结果的基础上[7-10]，对茶树蛋白质提取方法、蛋白上样量等因素进行探讨，旨在探索一种高质量的茶树叶片蛋白质提取方法及双向电泳技术体系，提高茶树蛋白质双向电泳图谱的分辨率，为后续茶树蛋白质组学的深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 2013年春于福建省武夷山市茶叶研究所采集茶树一芽二叶（武夷奇种18号），液氮固样，贮存于-80 ℃冰箱备用。

1.1.2 主要仪器与试剂 Ettan IPGphor等电聚焦仪、Ettan DALT six垂直电泳仪（美国GE Healthcare公司），透射扫描仪（EPSON Perfection 2480 Photo），高速冷冻离心机（美国Beckman公司），电泳仪、水平摇床（北京六一仪器厂），电子分析天平（德国Satorius公司），UV-Vis分光光度计（英国Biochrom公司），超低温冰箱（青岛海尔特种电器有限公司）。

四甲基乙二胺（TEMED）、β-巯基乙醇（β-Me）、硫脲（Thiourea）为Amersham Biosciences公司产品，矿物油、Triton X-100为北京索莱宝科技有限公司产品，固相pH梯度线性预制IPG干胶条（24 cm，pH4～7）、载体两性电解质（Biolyte，pH4～7）购自美国GE公司，三羟甲基氨基甲烷（Tris）、两性表面活性剂（CHAPS）、甘氨酸（glycerol）、30%丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29 ∶ 1）、低熔点琼脂糖、尿素（Urea）、碘乙酰胺（IAA）、二硫苏糖醇（Dithiothreitol，DTT）、十二烷基硫酸钠（SDS）购自生工生物工程（上海）股份有限公司，蛋白Marker、过硫酸铵（APS）、牛血清蛋白（BSA）等为美国Sigma产品，考马斯亮蓝G-250（CBB G-250）、甘油、丙酮、甲醛、无水碳酸钠、冰乙酸等为国产分析纯试剂，所有溶液均用超纯水配置。

1.2 方法

1.2.1 蛋白质干粉的制备 （1）改良酚抽法：参照Saravanan等[11]的方法并稍作改进。取1 g材料置液氮中充分研磨成粉末，加入4 mL预冷的酚抽提取液[100 mmol/L pH7.8 Tris-HCl，100 mmol/L KCl，50 mmol/L抗坏血酸，50 mmol/L硼砂，1%（V/V）Triton X-100，1%（V/V）β-Me]，待其融化后继续研磨数分钟，转移至10 mL离心管中；加入等体积的pH8.0 Tris-Phenol，涡旋震荡，13 000 ×g，4 ℃离心15 min，转移酚相至50 mL离心管中，加入5倍体积预冷的0.1 mol/L乙酸铵甲醇溶液，-20 ℃过夜沉淀；13 000 ×g，4 ℃离心15 min，弃上清液；将沉淀悬浮于预冷的甲醇溶液，-20 ℃静置2 h，13 000 ×g，4 ℃离心15 min，弃上清液；用预冷的含0.1% β-Me丙酮溶液清洗，13 000 ×g，4 ℃离心15 min，弃上清液；重复上述操作2～3次，离心，收集沉淀；用80%丙酮清洗，离心，收集沉淀，-20 ℃冷冻干燥，所得干粉置-80 ℃保存待用。

（2）TCA/丙酮沉淀法：参照Dameral等[12]的方法并稍作改进。取1 g材料置液氮中充分研磨成粉末，悬浮于10倍体积预冷的10% TCA/丙酮溶液，-20 ℃沉淀过夜，13 000 ×g，4 ℃离心15 min，弃上清，加入含0.07% DTT的丙酮清洗，13 000 ×g，4 ℃离心15 min，弃上清，重复丙酮沉淀直至上清无色，最后冷冻干燥-20 ℃保存。

1.2.2 蛋白裂解 称取10 mg蛋白质干粉于2 mL离心管中，加入300 μL样品裂解液[8 mol/L尿素，2 mol/L硫脲、2%（W/V）CHAPS、2%（V/V）两性电解质载体Biolyte]，冰浴超声波处理2 h，13 000 ×g，4 ℃离心15 min，取上清液用于蛋白质定量和双向电泳分析。

1.2.3 蛋白含量的测定 蛋白含量的测定参照Bradford等[13]的方法，以牛血清蛋白作为标准蛋白。

1.2.4 双向电泳分析 （1）第一向等电聚焦电泳（IEF）：采用Ettan IPGphor等电聚焦系统，24 cm、pH4～7 IPG预制干胶条。根据蛋白浓度测定结果，分别取含1.0、1.5 mg蛋白的样品溶液加水化液[8 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%（W/V）CHAPS、0.5%（V/V）IPG buffer、13 mmol/L DTT、0.002%（W/V）溴酚蓝]至总体积为450 μL。设置IEF程序，进行第一向等电聚焦（表1）。

（2）胶条平衡：将等电聚焦完成后的IPG胶条分别用平衡液Ⅰ[50 mmol/L pH8.8 Tris-HCl、6 mol/L尿素、30%（V/V）甘油、2%（W/V）SDS、0.002%（W/V）溴酚蓝、1%（W/V）DTT]、平衡液Ⅱ[50 mmol/L pH 8.8 Tris-HCl、6 mol/L尿素、30%（V/V）甘油、2%（W/V）SDS、0.002%（W/V）溴酚蓝、2.5%（W/V）碘乙酰胺]平衡15、20 min，平衡后取出胶条，用滤纸吸去残余平衡液，转移至第二向SDS-PAGE凝胶上。

（3）第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：采用Ettan DALT six垂直电泳系统和灌胶模具。将平衡好的胶条转移至12% SDS-PAGE凝胶上，用低熔点琼脂糖封胶液[0.5%（w/V）琼脂糖和0.002%（w/V）溴酚蓝溶于SDS电泳缓冲液，40 ℃左右为宜]封胶，然后进行凝胶配置（表2）。

14 ℃水循环条件下进行电泳，恒压运行，起初低电压80 V，1 h后待蛋白全部转移至PAGE胶上后，加大电压至250 V，待示踪的溴酚蓝到达凝胶底部边缘时停止电泳。

（4）考马斯亮蓝染色：电泳结束后迅速剥离凝胶，置于固定液（40%甲醇、10%乙酸，超纯水配置）中固定30 min后，用超纯水漂洗3次，每次15 min，然后将凝胶再置于染色液（0.05% G-250、50% 甲醇、10%乙酸，超纯水配置），室温摇床染色过夜，超纯水清洗至背景变浅、蛋白点清晰可见为止。

（5）凝胶扫描及分析：采用EPSON Perfection 2480 Photo透射扫描仪对脱色后的凝胶进行图像扫描，光学分辨率设为300 dpi（dot per inch），对比度与亮度采用软件默认值。图像分析采用PDQuest软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同蛋白质提取方法对2-DE图谱的影响

蛋白质样品的制备是进行蛋白质组学研究的基础和前提，是双向电泳能否成功的关键，直接影响图谱的质量和试验结果的可靠性、重复性。本试验分别对TCA/丙酮沉淀法和酚抽法提取蛋白质样品进行2-DE分离和染色，结果见图1。

TCA/丙酮沉淀法获得的蛋白质含量最少，裂解液溶解时不易分散，测得的蛋白浓度为12 μg/μL；酚抽法所得的蛋白质沉淀较多，易溶解，蛋白浓度为20 μg/μL。经PDQuest软件统计分析，在相同条件下进行双向电泳，TCA/丙酮沉淀法提取获得约600个蛋白点，蛋白点较少，图谱背景横纹较多且含有竖条纹；TCA/丙酮沉淀法虽操作简单，耗时短，但提取蛋白时受到酚类和多糖类等物质的干扰，蛋白质丢失现象严重，得到的蛋白粉末再溶解性较差，很难重新溶解[14]，影响了蛋白质的聚焦；改良酚抽法提取获得约1 300多个蛋白点，数量较多，虽操作相对繁复，但蛋白完整性高，纯度高，再溶解性好，所得图谱背景清晰、蛋白点分布均匀，横纵条纹及弥散状的蛋白质点较少，质量最佳。由此可见，改良酚抽法比较适合茶树叶片蛋白的提取，双向电泳分离效果好。

2.2 不同上样量对2-DE图谱的影响

蛋白质的上样量直接影响电泳图谱的质量，过高或过低都不能达到最佳的分离效果。本试验设2个水平上样量1.0、1.5 mg，对其进行双向电泳。由图2可知，上样量为1.0 mg时，蛋白点能较好的分开，但低分子量蛋白区域点缺失较多、低丰度蛋白较少，背景不够清晰，有横竖条纹，蛋白点有拖尾现象；上样量为1.5 mg时，蛋白检出率增高，蛋白点分布均匀，无扩散和拖尾现象，背景清晰。可见，蛋白上样量为1.5 mg时，所得图谱质量较好。

3 讨论与结论

3.1 样品制备

样品制备的好坏直接决定双向电泳图谱的分辨率、重复性、稳定性和分离效果。TCA/丙酮法和酚抽提法是2种最常用的蛋白质提取方法。茶树蛋白质组学研究开展的较晚，成果较少。林金科等[7]较早将改良后的TCA/丙酮法应用于茶树蛋白质组的样品制备，电泳图谱分辨出500个蛋白点，所得的蛋白质点数较少；李勤等[8]应用改良的Tris-HCl抽提法提取茶树总蛋白；任燕等[15]应用TCA/丙酮-clean up kit法提取茶树雌蕊总蛋白，获得清晰、分辨率高、重复性好的双向电泳图谱，共检测到约1 200个蛋白点。而酚抽法在茶叶蛋白的研究方面应用较少，但在果实蛋白质提取过程中应用较多（如桃、柑橘、苹果、葡萄等）[16]。本研究比较了TCA/丙酮法和改良酚抽法提取茶叶总蛋白的双向电泳结果，根据茶叶富含多糖多酚等次生代谢物质的特点，改良的酚抽法中乙酸铵甲醇沉淀过后又用预冷的含0.1%β-Me的丙酮溶液和80%的丙酮溶液分别再次清洗沉淀，用来破坏蛋白表面的水化膜，降低蛋白质水溶液的介电常数，从而达到沉淀蛋白的目的，提高蛋白得率，因此利用改良酚抽法提取茶树蛋白质，纯度高，再溶解性好，所得图谱背景清晰、蛋白点分布均匀，横纵条纹及弥散状的蛋白质点较少，适合茶树总蛋白质的提取。TCA/丙酮法可有效的沉淀蛋白质[12]，但不能彻底清除茶树中一些酚类、醛类等次生代谢物质及盐离子，致使蛋白图谱产生纵横条纹，达不到理想的分离效果[17]，此外，该方法所得的蛋白样品较难溶解[14]，造成蛋白点的丢失。这与李勤等[8]的研究结论相一致。

3.2 上样量选择

蛋白样品的上样量是影响双向电泳图谱的另一因素。上样量过低会导致一些低丰度蛋白在图谱上无法显现或不清晰，检测不到；上样量过大，聚焦时电压升的慢甚至不能达到所设定的电压，从而影响等电聚焦的效果，蛋白质点重叠、串联，在高相对分子质量的区域蛋白质展现不好，产生横向条纹，影响蛋白质的分离[18-19]。双向电泳最佳上样量受多种因素影响，需根据样品特性、IPG胶条长度和pH范围、聚焦时间、染色方法等，选用适当的蛋白上样量，提高双向电泳图像的质量。本研究在IPG预制胶条规格为24 cm、pH4～7的条件下，采用2个上样量进行双向凝胶电泳，发现上样量1.5 mg时，2-DE图谱蛋白质分离效果好、蛋白点数目多。

3.3 超声处理

本研究在裂解茶树蛋白干粉时，为了得到高质量的双向电泳图谱，采用冰浴超声法处理促进了蛋白沉淀的溶解。这与徐幼平等[1]的研究结果相一致。添加冰块可防止超声过程中水浴温度的上升，造成蛋白裂解液中的尿素变性，以免影响后续的第一向电泳。超声处理时强度和时间不宜过大、过长，以免导致蛋白降解。

综上所述，采用改良酚抽法更适合茶树总蛋白质的提取，结合超声助溶的方法、1.5 mg的蛋白质上样量，最终可获得蛋白质点较多、背景清晰、分辨率较高的双向电泳图谱，可满足茶树蛋白质组学的分析和研究，为进一步深入开展茶树差异蛋白质组学研究工作奠定了基础。

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责任编辑：黄东杰