戴永强 李津 伍爱民 鲍健 陆正齐 胡学强

多发性硬化与视神经脊髓炎患者的HLA-DRB1/ DPB1基因多态性

戴永强*李津*伍爱民*鲍健*陆正齐*胡学强*

目的比较HLA-DRB1/DPB1基因多态性在多发性硬化（multiple sclerosis,MS）和视神经脊髓炎（neuromyelitis,NMO）患者中的分布差异，并进一步探讨与上述两种疾病的相关性。方法采集53例MS患者、30例NMO患者和93名健康对照人群的血样，提取DNA后用直接测序法对HLA-DRB1、DPB1基因进行高分辨四位分型，比较各组间不同基因分型的表达率并进一步进行单倍体分析。入组者均为我国南方汉族人群。结果DPB1*0501在NMO患者中的表达率高于对照组，P=0.001，校正后P=0.022；DRB1*1602 DPB1*0501单倍体在NMO患者中的表达率高于MS患者组，P＜0.001，校正后P=0.040。结论在我国南方汉族人群中，MS、NMO患者HLA-DRB1/DPB1基因多态性存在明显差异，HLA-DPB1*0501可能是NMO发病的易感基因。

多发性硬化 视神经脊髓炎 人类白细胞抗原 多态性 单倍体

动物模型和临床资料表明多发性硬化（multiple sclerosis,MS）和视神经脊髓炎（neuromyelitis,NMO）均为中枢神经系统自身免疫性脱髓鞘疾病[1-2]，基因和环境因素共同参与二者的发病机制。人类白细胞抗原（human leucocyte antigen， HLA）基因与多种自身免疫性疾病相关，在MS、NMO发病中的作用也日益受到重视。既往研究发现HLA-DRB1*1501是西方人群中最常见的MS易感基因，携带者的患病风险较普通人群增加3倍[3]。NMO在西方国家相对于MS的发病率很低，约占中枢神经系统脱髓鞘疾病的1%～2%[4-5]，目前仅有小样本研究发现NMO患者HLA-DRB1*03、HLA-DRB3等基因的携带率明显增高[6-7]。亚洲人群NMO相对于MS的发病率明显高于西方人群，可达中枢神经系统脱髓鞘疾病的20%～48%[8]，这提示不同的基因背景可能影响疾病的发病率。本研究将对我科MS、NMO患者和健康对照者进行HLA-DRB1/DPB1基因的多态性进行对比研究，并进一步做单倍体分析，探讨我国南方汉族人群MS和NMO的易感基因。

1 对象与方法

1.1 研究对象NMO患者30例，其中女性23例，男性7例，NMO-IgG检测（间接免疫荧光法，德国EUROIMMUN公司NMO-IgG检测试剂盒）均为阳性（另有4例NMO患者因NMO-IgG阴性未予入组），MS患者53例，其中女31例，男22例，完全符合MS 2010年McDonald或NMO 2006年Wingerchuk诊断标准。以上患者血样来自2008～2011年我科脱髓鞘病例标本库。同时随机从我院2010年体检科随机选取93名健康人群做为对照。所有患者和对照均为南方汉族人群。

1.2 研究方法

1.2.1 血样采集与保存 采取患者和健康对照组血样5 mL，无菌EDTA管-80℃低温保存，使用Genebase bioscience有限公司DNA提取试剂盒提取DNA。

1.2.2 基因分型 采用直接测序法（Sequencing-based typing，SBT）对HLA-DRB1、DPB1进行高分辨四位分型，由深圳华大基因公司完成，对照基因库为IMGT/HLA 2.27.0。进一步使用软件Haploview1.4进行单倍体分析。

1.3 统计学方法采用SPSS 16.0进行统计学处理，卡方或精确概率法比较MS、NMO、健康对照组间HLA-DRB1、DPB1不同基因分型及单倍体的出现频率，并计算相对危险度（Odds ratios，Ors）。对所得P值进行Bonferroni-Dunn矫正，检验水准α= 0.05。

2 结果

2.1 HLA-DRB1、DPB1基因分型如表1所示，DRB1*0901在NMO患者中的出现频率高于对照组(P=0.022,OR：0.194,95%CI：0.043～0.876)。DRB1* 1602在NMO患者中高于MS患者(P=0.038,OR： 3.491,95%CI：1.024～11.896)和对照组(P=0.051,OR：2.711,95%CI：0.971～7.556)。但是上述结果经Bonferroni–Dunn校正后P值均大于0.05。如表2所示，DPB1*0501在NMO患者中的出现频率高于对照组(P=0.001,校正后P=0.022,OR：7.096, 95%CI：2.011～25.044)，较MS患者也有增高的趋势(P=0.018,OR：4.629,95%,CI：1.235～17.350)，但是校正后P值大于0.05。DRB1*1501位点在MS和NMO患者中的出现频率均未发现高于对照组。

表1 HLA-DRB1位点各基因分型的表达频率

2.2 单倍体分析NMO、MS患者组和对照组共发现单倍体123种，其中30名NMO患者出现31种单倍体，53名MS患者49种，93名对照组84种。由于单倍体类型繁多，每种出现频率较低，我们选取组内出现率超过10%的单倍体类型进行三组间出现率的比较（见表3）。结果发现DRB1*1602 DPB1*0501单倍体在MS和NMO组间的出现率有明显差异(P＜0.001,校正后P=0.040,OR：0.045,95%CI：0.005～0.377），DRB1*0405 DPB1*0501单倍体在MS组较对照组的出现率有增高的趋势(P＜0.001,OR：18.818,95%CI：2.311～153.210），校正后P=0.059。

3 讨论

本研究是对MS、NMO患者HLA II类基因DRB1和DPB1位点分布情况的病例对照研究，所有的病例及对照均为我国南方汉族人群。我们发现MS和NMO患者的基因分布存在差异，HLA-DPB1* 0501可能是我国NMO发病的易感基因。

HLA-DRB1*1501已被多个大样本研究证实为西方MS的主要相关位点[3,9]，在本研究入组人群中也并非罕见位点，各组的表达率均在20%以上。而我们未发现其与MS、NMO的相关性，这提示不同人种间致病基因存在异质性。2008年关于我国北方汉族MS的病例对照研究认为DRB1*15是MS的易感基因[10]。该研究与我们的入组标准不同，也未采用高分辨率4位点基因分型。另外汉族人群占我国总人数的90%以上，大体以长江为界约北纬30度分为南方汉族和北方汉族两个群体，二者基因背景也存在不同。

DPB1*0501位点在亚洲人群表达率达44.9%～73.1%，明显高于西方人群的2.6%～5.3%[11]。本研究3组人群表达率均超过55%，NMO组甚至达到了90%，统计发现DPB1*0501与NMO-IgG阳性的NMO患者相关而与MS患者无相关。日本的研究发现该位点在视神经脊髓型多发性硬化（opticospinal multiple sclerosis,OSMS）患者中的表达率明显增高，特别是NMO-IgG阳性的患者，而OSMS特别是NMO-IgG抗体阳性的患者被认为与NMO是同一种疾病。因而这项研究与我们在NMO患者中的发现相近[12]。在西方患者中，DPB1*0501并未发现与NMO相关，这一结果可能跟该位点在西方人群的低表达率有关。亚洲的研究显示携带DPB1*0501基因的人群对自身免疫性疾病的易感性高，包括早发的甲状腺炎、系统性红斑狼疮、1型糖尿病等[13]。提示该位点在亚洲人群自身免疫疾病中发挥作用。2009年一项关于我国南方汉族患者研究发现DPB1*0501在MS患者中出现频率明显增高，但是没有进行NMO-IgG的检测，如果依据MS 2010年McDonald和NMO 2006年Wingerchuk诊断标准，有可能把部分NMO诊断为MS[14]。

表2 HLA-DPB1位点各基因分型的表达频率

表3 各单倍体的表达频率

在本研究中，我们还发现DRB1*1602在NMO患者中携带率有高于MS患者的趋势，DRB1*0901在NMO患者中携带率有低于对照组的趋势，但是经过校正后这些差异未达到统计学意义。我国的另一项研究认为DRB1*1602是MS的易患基因，与我们的结论不同，这可能是入组诊断标准的差异造成[14]。澳大利亚的研究提示DRB1*0901可能是MS的保护性基因[15]，亚洲的研究也发现DRB1*09在NMO-IgG阳性的MS患者中表达率明显下降[16]。由此看来，我们发现DRB1*0901在NMO患者中表达率明显下降，与日本的研究结果较为一致。

不同HLAⅡ类基因位点组成的单倍体可以进一步影响对疾病的易感性，有研究认为西方人群DRB1*1501-DQA1*0102-DQB1*0602是MS的易感单倍体，可增加4-5倍的患病机率[17]。目前尚缺乏NMO患者单倍体的研究。本研究通过对单倍体的分析，发现DRB1*1602-DPB1*0501在MS、NMO患者间的出现率存在差别，后者明显增加，NMO较对照组的出现率也有增加的趋势，但校正后未达到统计学意义。DRB1*1602和DPB1*0501均是与体液免疫相关自身免疫疾病的易感基因[13]，它们的单倍体在NMO患者中的高表达率提示可能是NMO的易感单倍体，但需要大样本研究进一步证实。而我国另外一项研究却认为该单倍体与MS的发病相关[14]，可能与入组标准不同和样本量较小有关。DRB1*0405-DPB1*0501单倍体在MS患者中的出现率较NMO和对照组有增高的趋势，与后者的差异更为明显，校正后P值为0.059，接近有统计学意义。尽管DRB1*0405位点与MS的相关性没有DRB1*1501确切，亚洲、西方人群MS患者的研究均发现该位点出现率明显增高[18-19]。在单个基因位点和单倍体的分析中都涉及DPB1*0501基因，一方面提示与MS、NMO易感性相关，另一方面也应注意到该位点在亚洲人群的高表达率，我们的研究中MS患者、NMO患者、对照组的出现率分别为66.04%、90.00%、和55.91%。

总的说来，我国MS患者家族史罕见，临床特点与西方国家有所差别，而NMO的相对发病率明显高于西方，在本研究中，基因检测结果也与西方国家不同，而与亚洲国家类似。提示了基因因素影响着脱髓鞘疾病的发病。我们发现DPB1*0501在NMO患者中的出现率明显高于对照组，DRB1* 1602-DPB1*0501单倍体在NMO患者中的出现率明显高于MS患者，对开展我国南方汉族人群MS、NMO的基因诊断及鉴别诊断方面有较大的参考价值。但是研究样本量小，检测的基因位点有限，HLA基因与MS、NMO的关系有待进一步大规模的研究证实。

[1] Long Y,Gao C,Qiu W,et al.Antibodies target microvessels in neuromyelitis optica and multip le sclerosis patients[J].Neurol Res，2013，35(9)：922-929.

[2] 冯金洲,张广慧,燕伟平,等.雌激素抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠的NF-κB和Rho激酶表达[J].中国神经精神疾病杂志,2013,39(8)：479-483.

[3] DeLuca GC,Ramagopalan SV,Herrera BM,et al.An extremes of outcome strategy provides evidence that multiple sclerosis severity is determined by alleles at the HLA-DRB1 locus[J].Proc Natl Acad Sci USA,2007,104(52)：20896-20901.

[4] Cossburn M,Tackley G,Baker K,et al.The prevalence of neuromyelitis optica in South East Wales[J].Eur J Neurol，2012,19 (4)：655-659.

[5] Asgari N,Lillevang ST,Skejoe HP,et al.A population-based study of neuromyelitis optica in Caucasians[J].Neurology.2011, 76(18)：1589-1595.

[6] Zéphir H,Fajardy I,Outteryck O,et al.Is neuromyelitis optica associated with human leukocyte antigen [J].Mult Scler，2009,15(5)：571-579.

[7] BrumDG,Barreira AA,dos Santos AC.HLA-DRB association in neuromyelitis optica is different fromthat observed in multiple sclerosis[J].Mult Scler，2010,16(1)：21-29.

[8] Kira J.Multip le sclerosis in the Japanese population[J].Lancet Neurol，2003,2(2)：117-127.

[9] Modin H，Olsson W，Hillert J，et al．Modes of Action of HLA-DR Susceptibility Specificities in Multiple Sclerosis[J]．AmJ HumGenet，2004，74(6)：1321-1322.

[10] 方丽波，刘广志，王拥军，等.HLA-DRB1基因型与北方汉族多发性硬化易感性的研究[J].中国神经免疫学和神经病学杂志,2008,15（6）：400-403.

[11] Middleton D,Menchaca L,Rood H,et al.Newallele frequency database： http://www.allelefrequencies.net[J].TissueAntigens,2003,61(5)：403-407.

[12] Matsushita T,Matsuoka T,Isobe N.Association of the HLA-DPB1*0501 allele with anti-aquaporin-4 antibody positivity in Japanese patients with idiopathic central nervous systemdemyelinating disorders[J].Tissue Antigens,2009,73(2)： 171-176.

[13] Weetman AP.The genetics of autoimmune thyroid disease[J]. HormMetab Res,2009,41(6)：421-425.

[14] Wu XM,Wang C,Zhang KN,et al.Association of susceptibility to multiple sclerosis in Southern Han Chinese with HLA-DRB1,-DPB1 alleles and DRB1-DPB1 haplotypes：distinct fromother populations[J].Mult Scler,2009,15(12)： 1422-1430.

[15] Wu JS,James I,Wei Q,et al.Influence of HLA-DRB1 allele heterogeneity on disease risk and clinical course in a West Australian MS cohort：a high-resolution genotyping study.Mult Scler[J].2010,16(5)：526-532.

[16] Isobe N,Matsushita T,Yamasaki R,et al.Influence of HLA-DRB1 alleles on the susceptibility and resistance to multiple sclerosis in Japanese patients with respect to anti-aquaporin 4 antibody status[J].Mult Scler,2010,16(2)：147-155.

[17] Dyment DA,Ebers GC,Sadovnick AD,et al.Genetics of multiple sclerosis[J].Lancet Neurol,2004,3(2)：104-110.

[18] Huang J,Yoshimura S,Isobe N,et al.A NOTCH4 missense mutation confers resistance to multiple sclerosis in Japanese[J]. Mult Scler，2013,19(3)：1696-1703.

[19] Imrell K,LandtblomAM,Hillert J,et al.Multiple sclerosis with and without CSF bands：clinically indistinguishable but immunogenetically distinct[J].Neurology,2006,67：1062-1064.

The polymorphismof HLA-DRB1/DPB1 in multiple sclerosis and opticaneuromyelitis patients.

DAI Yongqiang,Li Jin，WU Aimin，BAO Jian，LU Zhengqi，HU Xueqiang.Department of Neurology,the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University,Guangzhou 510630,China.Tel：020-85252336.

ObjectiveTo explore the role of the polymorphismof HLA-DRB1/DPB1 in patients with multiple sclerosis(MS)and optica neuromyelitis(NMO).MethodsFifty-three patients with MS,30 patients with NMO and 93 normal controls were enrolled in the present study.The HLA-DRB1/DPB1 gene polymorphismand allele frequencies were determined by sequencing-based typing.All the subjects were Southern Han Chinese and were born in Southern China.ResultsThe frequencies of DPB1*0501 were higher in NMO patients than in controls,P=0.001,P(corrected)=0.022.The frequencies of DRB1*1602 DPB1*0501 hap lotype were higher in NMO patients than in MS patients,P＜0.001，P(corrected)=0.040.ConclusionsThere is significant difference in HLA-DRB1/DPB1 gene polymorphismbetween MS and NMO patients in a Southern Han Chinese population.The HLA-DPB1*0501 allele might be the susceptibility gene polymorphismof NMO.

Multiple sclerosis Neuromyelitis optica Human leucocyte antigen PolymorphismHaplotype

R744.5

A

2013-05-29）

（责任编辑：李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.07.004

*中山大学附属第三医院神经科（广州510630）