马向东 郭海丽

（1濮阳市食品药品检验所，河南濮阳 457000；2河南华峰制药有限公司）

H PLC法测定治伤消瘀丸中士的宁和马钱子碱的含量

马向东1郭海丽2

（1濮阳市食品药品检验所，河南濮阳 457000；2河南华峰制药有限公司）

目的：建立治伤消瘀丸中士的宁和马钱子碱含量测定的方法。方法：采用高效液相色谱法，色谱柱为Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇-0.01 mol/L磷酸氢二钾溶液（27∶73）（用10%磷酸调节pH至2.5）为流动相；流速为1.0 mL/min；柱温30℃；检测波长为260 nm。结果：士的宁在0.129 8～1.297 6 μg范围内线性关系良好（r=0.999 3，n=6），平均回收率为98.77%（RSD＝1.10%，n=6）；马钱子碱在0.110 7～1.107 2 μg范围内线性关系良好（r=0.999 1，n=6），平均回收率为98.73%（RSD＝0.68%，n=6）。结论：该方法操作简单，分离度高，回收率好，适用于治伤消瘀丸的质量控制。

治伤消瘀丸；士的宁；马钱子碱；高效液相色谱法；含量测定

治伤消瘀丸由马钱子（沙炒）、土鳖虫（炒）、乳香（制）、自然铜（煅、飞）、骨碎补（去毛）、没药（制）、麻黄、香附（制）、红花、蒲黄、赤芍、桃仁等14味中药组成，具有消瘀退肿功效，用于骨骼与关节损伤和瘀肿疼痛，适用于筋骨疼痛，跌打损伤，瘀血痹症，筋断骨折。原标准收载于《卫生部药品标准（中药成方制剂第十册）》，只有显微鉴别[1]。方中马钱子具有通络止痛，散结消肿的功效，为方中主药，且有大毒，必须加以控制。本研究参考有关文献，对方中主药马钱子中的士的宁和马钱子碱进行了含量测定的研究，建立了测定方法，为控制该产品的质量提供依据

1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪，配有四元梯度泵和Agilent chenstation数据工作站（DEABJ00471）；Sartorius CPA 225D分析天平（26190055）。

士的宁对照品（批号：110705-200306）、马钱子碱对照品（批号：110706-200510）均购自原中国药品生物制品检定所。治伤消瘀丸（规格：32粒重5 g，批号：20120901、20120902、20120903）及阴性对照品均由河南华峰制药有限公司提供；甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇-0.01 mol/L磷酸氢二钾溶液（27∶73）（用10%磷酸调节pH至2.5）作为流动相；流速为1.0 mL/min，柱温30℃，检测波长为260 mm。理论塔板数大于2 000，在此条件下，士的宁和马钱子碱与相邻组分均能达到完全分离。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取士的宁对照品16.22 mg和马钱子碱对照品13.84 mg至50 mL量瓶中，溶解并加甲醇至刻度，作为对照品储备液。再精密量取上述储备液5 mL至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成浓度分别为0.064 88，0.055 36 mg/mL的混合溶液，作为对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取本品10 g，研细，取约3 g，精密称定，置具塞三角瓶中，加氢氧化钠试液2 mL润湿后，精密加三氯甲烷50 mL,密塞，称定重量，振摇30 min，浸泡24 h，再称定重量，用三氯甲烷补足减失的重量，摇匀，滤过。精密吸取续滤液25 mL，置分液漏斗中，用0.5 mol/L的硫酸溶液提取3次，每次15 mL，合并酸液，滤过，滤液置50 mL量瓶中，用少量0.5 mol/L的硫酸溶液洗涤滤器，洗液与滤液合并，用0.5 mol/L的硫酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。另取不含马钱子药材的阴性对照品,按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.4 测定方法

分别吸取对照品溶液、样品溶液和阴性对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，测定，记录色谱图，以外标法分别计算士的宁和马钱子碱的含量。

2.5 阴性对照品的测定

取不含马钱子药材的阴性样品，按2.3项下方法操作，得阴性对照溶液。依法测定，结果表明阴性液无干扰。见图1

图1 治伤消瘀丸HPLC图

2.6 方法学考察

2.6.1 线性关系考察分别精密吸取对照品溶液各2，4，8，12，16，20 μL，按上述色谱条件进行测定，以进样量为横坐标，色谱峰面积为纵坐标分别进行作线性回归。结果士的宁、马钱子碱回归方程分别为：

表明士的宁在0.129 8～1.297 6 μg，马钱子碱在0.110 7～1.107 2 μg范围内线性关系良好。

2.6.2 精密度试验精密吸供试品溶液的10 μL，重复进样6次，分别记录士的宁和马钱子碱峰面积。结果士的宁和马钱子碱峰面积的RSD分别为0.76%，0.95%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.6.3 稳定性试验将供试品溶液分别在制备后0，1，2，4，8，12 h时进样测定。结果士的宁和马钱子碱峰面积的RSD分别为1.55%，1.80%（n= 6），表明12 h内样测定，样品稳定性良好。

2.6.4 重复性试验精密称取取同批号的样品（批号：111023），按供试品溶液的制备方法制备6份样品溶液，依法测定。分别计算含量和RSD，结果士的宁平均含量为1.437 mg/g，RSD为0.89%（n=6）。马钱子碱的含量为1.172 mg/g，RSD为1.39%（n=6）。

2.6.5 加样回收率试验采用加样回收法，精密称取样品6份，每份约3 g分别加入对照品储备液6 mL，照供试品溶液制备方法制备供试液，依法测定，结果见表1。

表1 回收率试验结果

2.7 样品含量测定

取样品（批号：111023，111215，120307）按2.2处理，按实验中所建立的方法进行测定，结果每克含士的宁分别为1.44，1.37，1.42 mg，马钱子碱分别含1.17，1.05，1.12 mg。

3 讨论

3.1 《中国药典》（2010年版）一部规定，马钱子药材中士的宁的含量为1.20%～2.20%，马钱子碱的含量不得少于0.80%[2]，查阅有关文献[3-5]并根据本公司的马钱子药材检验情况，在设计对照品浓度线性范围时，浓度选择相对较低。在数据处理时，对于样品处理过程中加入的2 mL氢氧化钠润湿试液，是否参与计算未找到相关文献，2 mL试液未定量加入，且基本被药材粉末吸收，综合考虑，未参与计算。

3.2 按药典马钱子的测定方法的流动相，乙腈-0.01 mol/L庚烷磺酸钠与0.02 moI/L磷酸二氢钾等量混合溶液（用10%磷酸调节pH值2.8）（21∶79）和0.01 mol/L磷酸氢二钾溶液-甲醇（73∶27）（用10%磷酸调节至pH至2.5）进行比较，结果士的宁和马钱子碱的出峰顺序正好相反；同为酸性缓冲盐，一个加乙腈，一个加甲醇为什么出峰顺序相反，有待进一步研究。当检测波长为254 nm，士的宁的峰高远大于马钱子碱，而在260 nm下检测，两者峰面积大小差别不大。综合考虑，甲醇-0.01 mol/L磷酸氢二钾溶液（27∶73）（用10%磷酸调节pH至2.5）为流动相，波长选择260 nm。

3.3 不同品牌色谱柱及填料比较Kromasil C18柱、Welchrom C18柱、Thermo ELECTRON CORPORATION ODS-3填料柱和依利特Sinochrom ODS-BP填料色谱柱，除了保留时间不同外，含量测定结果无明显差异。

3.4 本实验以士的宁和马钱子碱为指标，建立含量测定方法，经过方法验证，表明该方法重复性好，精密度高，稳定性好，回收率符合要求，可以用于本产品的质量控制。

[1]卫生部药典委员会.卫生部药品标准（中药成方制剂第十册）[S].1995：98.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典（2010年版）一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：47.

[3]郭社民.RP-HPLC测定治伤消瘀丸中士的宁的含量[J].中国药事，1999，13（6）：47.

[4]鲁燕侠，崔佳，刘鹰.反相高效液相色谱法同时测定祛痹丹胶囊中士的宁和马钱子的含量[J].中国医院药学杂志，2001，21（8）：474-475.

[5]刘元，宋志钊，莫海涛，等.HPLC法测定复方中风康片中士的宁和马钱子[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（6）：74-76.

Content Determination of Strychnine and Brucine in Zhishangxiaoyu Pills by HPLC

Ma Xiangdong1，Guo Haili2（1 The Institute for Food and Drug Control of Puyang City，Henan Puyang 457000，China；2 Huafeng Pharmaceutical Co.，Ltd.of Henan Province）

Objective：To establish a HPLC method for the content determination of strychnine and brucine in zhishangxiaoyu pills.Methods：Kromasil C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm）was used with methanol-0.01 mol/L potassium hydrogen phosphate solution（27∶73）（with 10%phosphoric acid for pH adjustment to 2.5）as mobile phase，the flow rate was 1.0 mL/min，column temperature was at 30℃and UV detection was at 260 nm.Results：The calibration curve was linear within the range of 0.129 8～1.297 6 μg（r=0.999 3，n=6）for strychnine and 0.110 7～1.107 2 μg（r= 0.999 1，n=6）for brucine，and the average recovery was and 98.77%（RSD=1.10%，n=6）and 98.73%（RSD=0.68%，n=6）for strychnine and brucine respectively.Conclusion：The method is simple with a high degree of separation and good recovery rate，it is suitable for the quality control of zhishangxiaoyu pills.

Zhishangxiaoyu Pills；Strychnine；Brucine；HPLC；Content Determination

10.3969/j.issn.1672-5433.2014.06.006

2014-01-21）

马向东，男，主管药师。研究方向：中药检验。通讯作者E-mail：1277311805@qq.com