晋晨晨，李 瑾，马 澜，陈毅华，郭波红

(广东药学院 药科学院，广东 广州 510006)



葛根素及其纳米混悬剂平衡溶解度测定

晋晨晨，李 瑾，马 澜，陈毅华，郭波红*

(广东药学院 药科学院，广东 广州 510006)

目的：测定葛根素及其纳米混悬剂在 pH1.2 盐酸溶液、水、pH7.4 PBS 缓冲液介质中的平衡溶解度。方法：采用高效液相色谱法(HPLC)测定葛根素及其纳米混悬剂在各个介质中的浓度。结果：在37℃下，葛根素纳米混悬剂在 pH1.2 盐酸溶液、水、pH7.4磷酸盐(PBS)缓冲液中的平衡溶解度分别为4.43、5.28、6.32mg·mL-1。结论：葛根素纳米混悬剂比原料药在各介质的溶解度均增加，在弱碱性介质中溶解度大于酸性介质，随pH升高而增大。葛根素水溶性较差，将其制备成纳米混悬剂有利于提高其溶解度。

葛根素；纳米混悬剂；平衡溶解度；高效液相色谱

葛根素化学名为8-β-D葡萄糖基-7,4′-二羟基异黄酮(8-β-D-Glucopyranosy-7,4′-hydroxyisoflavone)，可从豆科植物野葛的干燥根中提取得到，呈白色针状结晶[1]。具有扩张冠状动脉、降血压、降血脂、保护心肌及抗氧化、抗血栓形成、改善微循环等多种药理活性。作为改善心脑血管循环的新药，葛根素因毒性小、安全范围广、疗效好而极具临床应用价值，因此临床上常将其注射液用于冠心病、高血压、脑梗死、椎-基底动脉供血不足、糖尿病、突发性耳聋、青光眼等疾病的治疗。但用其注射在临床上易引起过敏性休克、急性溶血等不良反应[2]，而葛根素在水中的溶解度较低，仅为 0.011mol/L ，因此口服吸收差，体内的生物利用度低[3]。为了改善其水溶性，提高药物的生物利用度，可将其制备成纳米混悬剂[4-5]。葛根素纳米混悬剂通过减小药物粒子的粒径以增大其溶解度[6]，使药物溶出速度增加, 从而提高口服给药的生物利用度。

为了测定葛根素纳米混悬剂在不同介质中的溶解度，本实验采用摇床法，建立专属性强的高效液相分析方法，并进行相应的方法学验证。通过测定葛根素纳米混悬剂在不同介质中的溶解度，为改善葛根素的生物利用度研究提供理论基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

10AVP 高效液相色谱仪(日本岛津株式会社)；PKZ-1电热恒温振荡水浴振荡仪( 上海精密实验设备有限公司)；JA1003N 精密电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司)。

1.2 试药

葛根素(purity≥99%，上海诺特生物科技有限公司)；葛根素纳米混悬剂(实验室自制)；PVP K30(美国ISP公司)；HPLC Grade色谱甲醇(美国迪马公司)；柠檬酸(天津市百世化工有限公司)；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与方法专属性试验

色谱柱：Diamonsil C18色谱柱(250mm×4.6mm ，5μm)；流动相：甲醇-体积分数为1%枸橼酸水溶液(体积比25∶75)；柱温：30℃；流速：1.0mL·min-1；紫外检测波长：250nm；进样量：10μL。精密量取葛根素对照品溶液，供试品溶液及阴性溶液各10μL ，在上述色谱条件下注入液相色谱仪，依法测定，记录色谱图。实验结果表明，葛根素的保留时间为16.70min，峰对称性良好，理论塔板数不低于7 000。供试品中的辅料对主成分无干扰,见图1。

图1 阴性样品(A)/葛根素(B)和纳米混悬剂(C)色谱

2.2 对照品溶液制备

精密称取葛根素对照品10mg，置于25mL的容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为0.4mg·mL-1的对照品储备液。精密量取该储备液1mL，置于10mL容量瓶中,流动相稀释至刻度, 摇匀, 即得对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

精密量取葛根素纳米混悬剂溶液 500μL于 10mL容量瓶中，加入甲醇至刻度，摇匀。精密量取2.0mL，置于10mL 容量瓶中，流动相稀释至刻度，摇匀, 即得供试品溶液。

2.4 阴性样品溶液制备

取空白纳米混悬剂(不加入主药)，按“2.3”项下方法制成阴性样品溶液。

2.5 线性关系考察

分别精密量取对照品储备液适量，置10mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，混匀，制得质量浓度分别为 5、10、20、40、80、100μg·mL-1的对照溶液。分别进样10μL，依法进行测定，记录峰面积(A)。以峰面积(A)对质量浓度(C，μg·mL-1)绘制标准曲线，计算线性方程为A=40512C-39623 , r=0.9998。结果表明在5～100μg·mL-1范围内，葛根素的质量浓度和峰面积呈良好线性关系。

2.6 精密度试验

照“2.1”项下的色谱条件，取质量浓度为 40μg·mL-1的对照品溶液10μL注入液相色谱仪，记录色谱图。以上同批同1天内连续平行6次，根据主峰峰面积，计算出日内RSD为 0.82 % (n=6)；另取同一对照品溶液连续6天每日平行1次，根据主峰峰面积，计算出日间RSD为 1.30 %(n=6)。

2.7 重复性试验

照“2.3”项下供试品溶液的制备方法配制供试品溶液，照“2.1”项下的色谱条件，取上述供试品溶液进样6次平行测定，得主成分含量的RSD为0.71%(n=6)。

2.8 稳定性试验

取供试品溶液，在室温下静置，并在0、2、4、8、12、24h分别取样10μL，经HPLC分析，计算得各时间点峰面积(A)的平均值为0h时测定值的100.2%、100.3%、100.1%、99.7%、100.2%。实验表明该溶液在常温下24h内稳定。

2.9 定量限的确定

取葛根素对照品溶液，加甲醇水溶液逐级稀释，进行HPLC分析，测得定量限( S/N=10)为32ng。

2.10 回收率试验

精密量取1.0mL的空白纳米混悬剂9份，分别置于10mL量瓶中，精密加入0.4mg·mL-1对照品储备液 0.25、1.0、2.5mL各3份，并用流动相稀释至刻度，混匀。分别进样10μL，记录峰面积，计算回收率。结果表明高、中、低3个水平的回收率分别为99.4%( RSD 为 1.2%，n=3 )、98.7%(RSD为1.3%，n=3)、100.2%(RSD为1.1%，n=3)，平均回收率为99.43%( n=9)。

2.11 平衡溶解度测定

称取过量葛根素原料药及葛根素喷雾干燥纳米混悬剂粉末置于25mL 具塞三角瓶中, 加入10mL 蒸馏水，超声处理使粉末充分分散后，置37℃恒温水浴振荡仪中振荡24h后取出[7-8]，用 0.45μm微孔滤膜过滤。分别精密吸取滤液，用流动相适当稀释后，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积。根据标准曲线按照公式计算可得饱和溶解度(C)。另外以相同的条件在pH1.2盐酸溶液、 pH7.4 PBS 缓冲液中分别测定葛根素原料药及其纳米混悬剂的饱和溶解度。平行做3份，结果见图2。

结果表明，原料药在 pH1.2 盐酸溶液、水、pH7.4 PBS 缓冲液中的饱和溶解度分别为 2.05mg·mL-1、2.78mg·mL-1、3.02mg·mL-1，纳米混悬剂的饱和溶解度分别为 4.43mg·mL-1、5.28mg·mL-1、6.32mg·mL-1。说明将葛根素制备为纳米混悬剂可以显著提高其溶解度。

图2 37℃下不同pH介质中葛根素及其纳米

3 讨论

本实验制备葛根素纳米混悬剂方法简单，并且辅料对测定无干扰作用。采用高效液相方法，样品各项指标均达到药物分析研究的方法学要求，重现性好，是一种高效、灵敏、专一、简便的测定方法。

根据溶解度的测定结果，制成葛根素纳米混悬剂后，其溶解度是原料药的2倍。制成纳米混悬剂，可以使其粒径减小，实验已测得葛根素原料药的粒径为3μm，而其纳米混悬剂的粒径为195nm (另文发表)，粒径显著减小。根据Ostwald-Freundlich 方程 (公式1)，难溶性药物粒子大小会影响溶解度[6]，药物粒子越小，其溶解度越大，故将葛根素制成纳米混悬剂能够显著提高溶解度，从而提高其溶出速率。

(1)

S1、S2分别是半径为r1、r2的药物溶解度，σ为固体药物与液态溶剂之间的界面张力，M为药物的分子量，ρ为固体药物的密度，R为气体常数，T为热力学温度。

在纳米混悬剂中，常采用加入表面活性剂或高分子聚合物作为稳定剂来抑制药物粒子间的聚集沉积[3]。本实验采用PVP K30作为载体，可制备稳定的葛根素纳米混悬剂。这可能由于其表面活性作用，PVP K30与葛根素结合后可降低药物颗粒的表面张力，在葛根素粒子表面形成致密界面，减少内部药物分子向水相扩散，从而抑制粒子聚集。PVP分子在水中溶胀伸展，具有一定空间稳定作用，可有效抑制葛根素药物粒子间的聚集沉积，保证葛根素纳米混悬剂具有较好的稳定性。

通过在不同pH介质中的溶解度比较，可以看出随着pH的增大，其溶解度也增大。人体正常的生理环境pH大致为3.0～8.0，所以通常采用pH1.2盐酸、水和pH7.4 PBS缓冲液来进行溶解度的实验。本实验中葛根素在碱性介质中的溶解度大于其在酸性介质中的溶解度，其可能的原因是葛根素为7,4′-二羟基异黄酮，显酸性，在弱碱性的介质中形成复合物或盐增大其溶解度；也可能是羟基在碱性介质中解离使其水溶性增大。

[1] 王靖，吉民，华维一，等.葛根素研究进展[J]. 药学进展，2003, 27(2)：70-73.

[2] 刘绍德, 莫惠平. 葛根素注射液的不良反应及预防[J]. 中国中西医结合杂志，2005, 25(9)：852-855.

[3] 王展，韩立炜，任天池. 葛根素-聚乙二醇6000固体分散体的制备及其溶解性能的研究[J].北京中医药大学学报，2007，30(5): 346-349.

[4] LUO C F，YUAN M, CHEN M S, et al. Pharmacokinetics, tissue distribution and relative bioavailability of puerarin solid lipid nanoparticles following oral administration[J]. Int J Pharm,2011,410:138-144.

[5] WANG Y C, MA Y, MA Y Y, et al. Formulation and pharmacokinetics evaluation of puerarin nanocrystals for intravenous delivery[J].J Nanosci Nanotechnol,2012,12:6176-6184.

[6] MAULUDIN R,MULLER R H,KECK C M,et al. Kinetic solubility and dissolution velocity of rutin nanocrystals[J]. Eur J Pharm Sci,2009,36(4-5):10-502.

[7] 王晓蕾，孙艺丹，王锐利，等. 蒿甲醚在不同介质中的平衡溶解度及表观油水分配系数的测定[J]. 药物评价研究，2013，36(2): 114-118.

[8] 熊耀坤，梁爽，杜焰，等. HPLC法测定洋川芎内酯Ⅰ的平衡溶解度和表观油水分配系数[J]. 药物分析杂志，2012，32(9)：1644-1647.

(责任编辑：魏 晓)

Determination of Equilibrium Solubility of Puerarin and Puerarin Nanosuspension in Various Media

Jin Chenchen, Li Jin, Ma Lan, Chen Yihua，Guo Bohong

(School of pharmacy, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China)

Objective:To determine the equilibrium solubility of puerarin and its nanosuspension in various media, such as pH1.2 acid solution, water, and pH7.4 PBS buffer.Methods:High performance liquid chromatography (HPLC) was used to determine the concentration of puerarin nanosuspension in different media.Results:The equilibrium solubility of puerarin nanosuspension in pH1.2 acid solution, water, and pH7.4 PBS buffer at 37 ℃ was 4.43, 5.28 and 6.32mg·mL-1, respectively. Conclusion:The equilibrium solubility of puerarin nanosuspension is higher than the equilibrium solubility of puerarin，in alkaline phosphate buffer than in others and is higher with the increase of pH. Water solubility of puerarin is poor, puerarin nanosuspension may have the possibility to enhance its dissolution rate.

Puerarin; Nanosuspension; Equilibrium Solubility; High Performance Liquid Chromatography

2014-02-03

晋晨晨(1992-)，女，广东药学院在读生。

郭波红(1976-)，女，广东药学院药科学院副教授，研究方向为药物新剂型与新技术。

R283.6

A

1673-2197(2014)11-0041-03