赵 瑾，田俏梅，吴白平

(湖南省肿瘤医院/中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院，湖南长沙410013)

目前，针对初诊的非小细胞肺癌晚期患者应常规检测表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因突变，用于选择是否一线或二线使用非替尼、厄洛替尼等小分子酪氨酸酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)。目前临床用于EGFR检测的标本主要是肿瘤组织学和细胞学标本，包括手术切除标本、活检组织标本、新鲜穿刺标本以及胸腔积液、痰液等。血液学标本目前处于临床研究阶段，暂

未在临床进行使用。由于胸腔积液中的肿瘤细胞数量较少，其主要用于无法获得组织标本的情况下使用，且需要灵敏度较高的检测方法才能提高EGFR基因突变的检出率。本研究针对中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院存档的非小细胞肺癌活检标本和胸腔积液标本，用焦磷酸测序的方法检测EGFR基因18～21外显子突变检测，探讨胸腔积液作为晚期非小细胞肺癌患者EGFR基因检测标本的临床意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2013－03～2014－02中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院肿瘤医院初诊的非小细胞肺癌患者胸腔镜活检标本43例，配对收集相同患者胸腔积液43例。其中男24例，女19例，中位年龄58岁。病理组织类型为腺癌36例、鳞癌7例。

1.2 样本的采集和处理

收集患者胸腔镜下新鲜活检标本和50ml胸腔积液，胸腔积液在室温下13000r/min离心10min，弃上清，将细胞沉淀进行细胞涂片，经病理医生评估后，确保为非小细胞肺癌标本，且肿瘤细胞含量＞5%后，立即常温下送至检验科。采集同一患者配对的新鲜活检组织，采用中性福尔马林溶液固定及石蜡包埋，经病理医生评估选取肿瘤细胞含量＞10%以上的石蜡组织，切取5μm厚的石蜡白片10～15片，置于无菌的EP管中，用二甲苯和无水乙醇脱蜡后沉淀、烘干。

1.3 基因组DNA提取

采用德国凯杰公司的QIAamp DNA FFPE Tissue试剂盒(货号:56404)，按试剂盒说明书操作提取基因组DNA，用上海元析公司的B－500超微量分光光度计测定DNA纯度及含量，要求 A280/A260＞1.80。

1.4 PCR扩增和焦磷酸测序

采用长沙三济生物科技有限公司的EGFR基因突变检测试剂盒，对EGFR基因18～21外显子进行PCR扩增和PCR产物的焦磷酸测序，所有操作按试剂盒说明书进行，实验全程设立阴阳对照。采用德国凯杰公司的PyroMark Q24焦磷酸测序仪进行测序。将得到的基因序列与Genbank中的EGFR基因标准序列(序列号:NG_007726)进行比对，分析测序结果。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，卡方检验，检验水准α=0.05，以P ＞ 0.05为差异无统计学意义，P ＜ 0.05为差异具体统计学意义。

2 结果

2.1 活检标本EGFR基因突变率

43例胸腔镜下非小细胞肺癌活检标本中检出EGFR基因突变型12例，野生型31例，EGFR基因突变率为27.9%(12/43)。其中，EGFR基因第19外显子突变8例，突变率为66.6%(8/12)，第21外显子突变8例，突变率为33.3%(4/12)，见图1。

图1 焦磷酸测序检测EGFR基因突变

2.2 胸腔积液标本EGFR基因突变率

胸腔积液标本中检出EGFR基因突变型11例，野生型32例，EGFR基因突变率为25.6%(11/43)。胸腔积液标本EGFR基因检测结果有一例与配对活检组织不符合，其他结果均一致，见图2。胸腔积液中细胞的EGFR基因突变率略低于活检组织标本，但两者差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 非小细胞肺癌胸腔镜下活检标本EGFR基因突变率(n=43)

图2 同一患者胸腔积液标本与活检组织标本中EGFR基因检测不符合的测序

3 讨论

肺癌的死亡率在世界范围内的癌症中最高，绝大部分的肺癌为非小细胞肺癌。改癌症的药物靶向治疗是目前较先进的技术之一。其EGFR基因是参与调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、血管生成和转移，是非小细胞肺癌重要的治疗靶点之一［1］。而治疗的疗效往往可通过对EGFR基因的突变检测进行评价，酪氨酸激酶抑制剂(TKI)为靶向治疗的药物，非小细胞肺癌的EGFR基因突变与TKI有特异性反应，也是预测KTI治疗疗效的指标之一，因此对非小细胞肺癌中EGFR基因突变的检测就能评估治疗的疗效［2～4］。那么对于肿瘤基因的提取是整个评价过程的关键，通常可以选用肿瘤组织小活检标本进行，但活检不仅有创也较为复杂。而目前较多的研究表明，非小细胞肺癌晚期患者往往会有胸腔积液，且在积液中能发现肿瘤细胞［5］。因此胸腔积液也能提取EGFR基因进行突变检测而代替小活检组织标本。

本研究通过配对收集相同患者的肿瘤组织小活检标本与患者的胸腔积液采用PCR扩增和焦磷酸测序的方法来对比分析两种标本是否存在检测结果的一致性。结果表明，胸腔镜下非小细胞肺癌活检标本检出EGFR基因突变型12例，EGFR基因突变率为27.9%(12/43)。胸腔积液标本共检出EGFR基因突变型11例，EGFR基因突变率为25.6%(11/43)，差异无统计学意义(P＞0.05)，这与国内外多数研究的结果基本一致［6～8］。然而国外有研究却不支持改观点［9］，本研究通过仔细核对标本的收集、送检、数据分析以及对比的研究的可靠性，结果还是胸腔积液标本与肿瘤组织小活检标本结果无差异，支持胸腔积液标本能代替小活检标本进行检测。

此外，在本研究中发现胸腔积液标本EGFR基因检测结果有一例与配对活检组织不符合，其他结果均一致，这可能是胸腔积液肿瘤基因突变存在异质性有关，具体可能为靶向治疗后基因的检测的变换，更大的可能性为肿瘤的转移与原发病灶不一样。那么对于这种现象，可以在胸腔积液标本检测的基础上取肿瘤组织标本进行检测，理论上活检组织的检测结果更支持临床需要。

通过实验以及参照文献，基本可以认为非小细胞肺癌患者的胸腔积液标本能够代替肿瘤组织活检标本对EGFR基因突变的检测。基于此观点，由于胸腔积液的收集更为简便，检测也较可靠，在临床上可以参考应用。

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