常小洁 郭奇桑 李笑天

(复旦大学附属妇产科医院产科 上海 200011)

过氧化氢诱导人胎盘滋养细胞HTR-8/SVneo氧化应激模型的建立

常小洁 郭奇桑 李笑天△

(复旦大学附属妇产科医院产科 上海 200011)

目的通过研究不同浓度过氧化氢(H2O2)作用不同时间对人胎盘滋养细胞HTR-8/SVneo氧化应激水平的影响,确定建立滋养细胞氧化应激模型的条件。方法将HTR-8/SVneo用不同浓度(125、250、500μmol/L)H2O2分别处理不同时间(1、2、4、24 h)后,采用CCK-8法检测细胞存活率；流式细胞术分析检测细胞内超氧化物阴离子水平以及细胞凋亡情况；紫外分光光度法检测细胞培养上清液中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性以及乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)含量。结果随H2O2浓度增加及作用时间延长,HTR-8/SVneo细胞存活率逐渐下降,细胞内超氧化物阴离子含量及细胞凋亡率不断增加,细胞培养上清液中SOD活性逐渐降低、LDH含量不断升高。其中在250μmol/L H2O2作用4 h条件下,SOD活性明显低于对照组(P＜0.05),细胞内超氧化物阴离子水平及细胞凋亡率较对照组均显著增加(P＜0.05),但LDH漏出量无明显增多(P＞0.05),且该条件下细胞有较高的存活率(85.13%)。结论建立人胎盘滋养细胞HTR-8/SVneo氧化应激模型的最适条件为250μmol/L H2O2作用4 h。

胎盘滋养细胞； HTR-8/SVneo； 过氧化氢(H2O2)； 氧化应激； 增殖； 凋亡

氧化应激(oxidative stress)是指细胞内氧化和抗氧化系统失衡,导致活性氧(reactive oxygen species,ROS)自由基产生速率大于清除速率,从而引起细胞和组织损伤的一种病理状态。氧化损伤主要包括生物膜脂质过氧化、细胞内蛋白及酶变性、DNA损害,最后导致细胞死亡或凋亡,并引发疾病［1］。正常妊娠过程中,机体的氧化和抗氧化作用保持相对平衡,不会发生氧化应激［2-3］。当胎盘缺血缺氧时,胎盘滋养细胞发生氧化应激,产生大量ROS,超过上述抗氧化系统代偿能力,从而引起胎盘功能障碍。目前认为氧化应激在子痫前期、胎儿宫内窘迫、胎儿宫内生长受限、流产等妊娠疾病的发病中起重要作用［4-8］。因此构建人胎盘滋养细胞氧化应激模型非常重要。

过氧化氢(H2O2)是一种重要的活性氧,极易透过细胞膜,与细胞内铁离子通过Fenton反应形成高活性的自由基,导致一系列反应,其易于获得,性质相对稳定,已成为国内外研究细胞氧化损伤的重要工具［9-11］。本研究以人胎盘滋养细胞系HTR-8/ SVneo为研究对象,利用不同浓度H2O2作用不同时间,通过检测细胞增殖、凋亡、细胞内超氧阴离子含量及细胞培养上清液中SOD活性和LDH含量等指标,确定构建人胎盘滋养细胞HTR-8/SVneo氧化应激模型的最佳条件。

材料和方法

材料人胎盘滋养细胞株HTR-8/SVneo由加拿大多伦多大学Graham教授惠赠；H2O2购自美国Sigma-Aldrich公司；CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒购自日本株式会社上海同仁化学研究所；超氧化物歧化酶(SOD)测试盒、乳酸脱氢酶(LDH)测试盒购自南京建成生物工程研究所；超氧化物阴离子荧光探针(Dihydroethidium,DHE)购自江苏碧云天生物技术研究所；Alexa FluorR488 Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒购自美国Invitrogen公司；DMEM/F12培养基、胎牛血清和0.25%胰酶均购自美国Gibco公司。

CCK-8法检测细胞存活率取对数生长期的HTR-8/SVneo,以每孔5×103个接种于96孔板中,置于37℃、5%CO2培养箱中培养。24 h后,实验组分别给予不同终浓度的H2O2(125、250、500 μmol/L),同时设立对照组,每个浓度设6个复孔。相同条件下分别继续培养1、2、4、24 h后,吸弃培液,PBS洗2遍,加入提前配制好的CCK-8工作液110μL(CCK-8与培养基体积比为1∶10),置于37℃培养箱继续孵育2 h,在自动酶标仪上检测450 nm波长处各孔吸光度(D)值。按下述公式计算细胞存活率：存活率(%)=(实验组D/对照组D) ×100%。

流式细胞术检测细胞内超氧化物阴离子水平

取对数生长期的HTR-8/SVneo,以每孔5×104个接种于12孔板,置于37℃、5%CO2培养箱中培养。24 h后,实验组分别给予不同终浓度的H2O2(125、250、500μmol/L),同时设立对照组,每个浓度设3个复孔。相同条件下分别继续培养1、2、4、24 h后,用不含EDTA的0.25%胰酶消化,收集细胞,1 000 r/min离心5 min(离心半径10 cm),PBS洗2遍,用1 mL DHE(5μmol/L)重悬,37℃避光孵育30 min, 1 000 r/min离心5 min(离心半径10 cm),PBS洗2遍,用300μL PBS重悬,用流式细胞仪进行检测。结

果用平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)及MFI Fold of control表示(即实验组MFI/对照组MFI)。

流式细胞术检测细胞凋亡取对数生长期的HTR-8/SVneo,以每孔1×105个接种于6孔板,置于37℃、5%CO2培养箱中培养。24 h后,实验组分别给予不同终浓度的H2O2(125、250、500μmol/ L),同时设立对照组,每个浓度设3个复孔。相同条件分别继续培养1、2、4、24 h后,用不含EDTA的0.25%胰酶消化,收集细胞,1 000 r/min离心5 min,冰PBS洗2遍,用100μL 1×结合缓冲液重悬,分别加入2.5μL Annexin V-FITC和1μL PI,混匀,室温(25℃)避光孵育15 min,加入200μL 1 ×结合缓冲液,样品置冰上,1 h内用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

检测细胞培养上清液中SOD活性及LDH含量取对数生长期的HTR-8/SVneo,以每孔2.5×104个加于24孔板中,置于37℃、5%CO2培养箱中培养。24 h后,实验组分别给予不同终浓度的H2O2(125、250、500μmol/L),同时设立对照组,每个浓度设3个复孔。相同条件下分别继续培养1、2、4、24 h后,按试剂盒说明书分别检测细胞培养上清液中SOD活性及LDH含量。

倒置相差显微镜观察细胞形态学改变取对数生长期的HTR-8/SVneo,以每孔1×105个接种于6孔板,置于37℃、5%CO2培养箱中培养。24 h后,实验组分别给予不同终浓度的H2O2(125、250、500μmol/L),同时设立对照组。相同条件下分别继续培养4 h后,PBS洗2遍,立即于倒置相差显微镜下,以同样倍数(10×)观察细胞形态改变并拍照。

统计学处理实验重复3次,采用SPSS 16.0统计软件分析,数据以x—±s表示,多组比较用单因素方差分析,两两比较采用最小显著差异(LSD)法。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

CCK-8法检测H2O2对HTR-8/SVneo细胞存活率的影响从图1可以看出,125、250μmol/L H2O2对HTR-8/SVneo细胞增殖的抑制作用不明显,细胞存活率均在80%以上。其中250μmol/L H2O2作用4 h的细胞存活率为85.13%；125μmol/L H2O2作用4、24 h的细胞存活率＞100%,但其D均值较对照组差异无统计学意义(P＞0.05)。500 μmol/L H2O2对HTR-8/SVneo细胞杀伤性较大,细胞存活率明显下降,且呈现出时间依赖性。

H2O2对HTR-8/SVneo细胞内超氧化物阴离子水平的影响对照组在不同时间点的MFI值基本相同,取平均值后对照组MFI为83.54。结果显示,H2O2对细胞MFI水平的影响呈现出明显的浓度和时间依赖性。与对照组比较,只有125μmol/L H2O2作用1、2 h细胞MFI无显著升高(P＞0.05)；250μmol/L H2O2作用4 h细胞MFI为103.66,明显高于对照组(P＜0.05),说明细胞内ROS生成增多,细胞发生了氧化应激。500μmol/L H2O2作用24 h造成大部分细胞死亡,无法进行流式检测,故数据缺如(图2A、B)。

H2O2对HTR-8/SVneo细胞凋亡的影响由图3A、B可见,与对照组比较,125μmol/L H2O2作用1、2、4 h引起的细胞凋亡率只有轻度增加(P＞0.05),其中2 h和4 h凋亡率较1 h不仅没有升高反而有所下降,但三者之间的差异无统计学意义(1 h vs.2 h,P=0.071；1 h vs.4 h,P=0.315；2 h vs. 4 h,P=0.387)。随作用时间延长,250μmol/L H2O2处理组的细胞凋亡率不断增加,其中250 μmol/L H2O2作用4 h的细胞凋亡率为7.72%。由图2A/C-2可以看出,500μmol/L H2O2作用4 h引起的HTR-8/SVneo早期凋亡率只有2.37%,但晚期凋亡+坏死率高达39.44%,说明该处理对细胞损伤较大,导致细胞坏死。随500μmol/L H2O2作用时间延长,大部分细胞坏死漂浮在培养上清液中,无法进行凋亡检测,故500μmol/L H2O2组只检测了作用1、4 h的细胞凋亡情况。

H2O2对HTR-8/SVneo细胞培养上清液中SOD活性及LDH含量的影响如图4A所示,与对照组和125μmol/L H2O2处理组相比,250和500 μmol/L H2O2明显降低了细胞培养上清液中SOD活性(P＜0.05)；与对照组相比,125μmol/L H2O2作用2、4 h未引起SOD活性显著下降,其中4 h组SOD活性反而升高,但差异无统计学意义(P= 0.22)。如图4B所示,当H2O2作用2 h时,虽然组间存在差异(F=4.617,P=0.037),但与对照组相比,各处理组细胞培养上清液中LDH含量均无明显变化(P＞0.05)。当H2O2作用4 h时,125 μmol/L处理组LDH含量明显下降,差异有统计学意义(P＜0.05)；500μmol/L处理组LDH含量则显著升高(P＜0.05),而250μmol/L处理组细胞培养上清液中LDH含量升高仍不明显(P=0.067),说明250μmol/L H2O2作用4 h对细胞膜的损伤较小。

细胞形态学的改变由图5可见,对照组HTR-8/SVneo细胞形态结构正常、细胞轮廓清晰；125μmol/L H2O2处理组细胞形态无明显改变；250和500μmol/L H2O2处理组细胞形态发生明显改变,细胞皱缩、间隙增宽、体积缩小,有些呈片状坏死脱落,存活细胞相应减少。

讨 论

氧化应激反映了细胞内ROS生成和清除的不平衡状态。生理状态下,ROS产生的毒性能够被抗氧化酶如SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GHPx)、过氧化氢酶及其他非酶类抗氧化物质清除。一旦ROS生成超过清除速率时,细胞就会发生氧化损伤。研究表明,胎盘滋养细胞氧化应激参与多种妊娠疾病的发生,包括流产、子痫前期、胎儿生长受限等［7,12］。因此建立胎盘滋养细胞氧化应激模型有重要意义。

SOD是机体抗氧化损伤防御体系中最重要的抗氧化酶之一,具有抗自由基损伤作用。在病理状态下,机体抗氧化能力不同程度增强,表现为SOD活性代偿性增高；当自由基大量产生时,SOD被大量消耗而合成发生障碍,导致其水平下降且活性受到抑制,因而检测SOD活性可反映机体清除氧自由基的能力。LDH在氧化应激致细胞膜受损时漏到细胞外的上清液中,因此细胞上清液中LDH含量越高,说明细胞氧化损伤越严重。DHE被细胞摄入后,在细胞内产生溴化乙锭,后者与RNA或DNA结合产生红色荧光,荧光强度反映了细胞内ROS水平,是细胞发生氧化应激的直接标志。细胞凋亡率也是反映细胞氧化损伤程度的重要指标,但当氧化损伤非常严重时,细胞不发生凋亡而是直接坏死［13］。本实验中,500μmol/L H2O2作用4 h时,细胞早期凋亡率仅为2.37%,反而低于较低浓度H2O2组,但细胞坏死率高达39.44%,亦证明了细胞凋亡率高低与氧化损伤严重程度并非完全正相关。

H2O2是目前建立细胞氧化应激模型最常用的物质,已被广泛应用于各个领域的研究［10-11,14-15］。本研究使用H2O2成功诱导HTR-8/SVneo细胞发生氧化应激,从整体趋势来看,随H2O2浓度增加、作用时间延长,细胞存活率及SOD活性逐渐降低, LDH漏出量及细胞内超氧化物阴离子等活性氧物质逐渐增加,细胞凋亡及坏死率亦不断增加,提示细胞氧化应激程度及损伤程度不断加剧。此外本研究发现,当125μmol/L H2O2作用时间延长至4 h时,抑制细胞增殖的作用反而变得不明显,SOD活性也有所增强。推测这是细胞内氧化-抗氧化平衡系统中的抗氧化物质生成增加并逐渐占据主导作用的结果,该现象及其机制有待进一步研究。目前已有研究表明,较低程度的氧化应激和脂质过氧化可以通过不同机制促进细胞增殖［16］。综上所述,考虑选用250μmol/L H2O2作用4 h作为建立HTR-8/ SVneo细胞氧化应激模型的条件。该条件下,细胞内超氧化物阴离子水平及细胞凋亡率显著增加(P＜0.05),SOD活性亦明显降低(P＜0.05),说明细胞发生了一定程度氧化应激。同时,LDH漏出量无明显增多(P＞0.05),表明细胞膜损伤不严重；且该条件下细胞有较高的存活率(85.13%),便于进一步的实验研究。

由于获得和培养胎盘原代滋养细胞比较困难,并且在分离和短期应用中,细胞功能可发生一些潜在的变化,因此原代滋养细胞在实验中的应用受到限制。本实验应用的人胎盘滋养细胞系HTR-8/ SVneo是最接近于原代滋养细胞的细胞系。既往有研究发现原代细胞和HTR-8/SVneo细胞系对H2O2的反应有一定差异［17］。因此,用HTR-8/ SVneo细胞系代替原代细胞进行实验仍存在一定局限性。

综上所述,本研究使用H2O2成功诱导HTR-8/ SVneo细胞发生了氧化应激,并且确立250μmol/L H2O2作用4 h是建立人胎盘滋养细胞HTR-8/ SVneo氧化应激模型的最佳条件。该模型能够进一步应用于胎盘滋养细胞氧化应激相关的实验研究,有望在子痫前期、流产、胎儿生长受限等妊娠疾病的发病机制和治疗方法研究方面作出贡献。

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Establishment of hydrogen peroxide-induced oxidative stress model in HTR-8/SVneo cells

CHANG Xiao-jie,GUO Qi-sang,LI Xiao-tian△
(Department of Obstetrics,Obstetrics and Gynecology Hospital,Fudan University,Shanghai 200011,China)

Objective To establish the oxidative stress model of human trophoblast cells by studying the effects of hydrogen peroxide(H2O2)on the cell line HTR-8/SVneo.MethodsHTR-8/SVneo cells were treated with different concentrations(125,250,500μmol/L)of H2O2for different time(1, 2,4,24 hours).Cell viability was measured by CCK-8 assay.Superoxide dismutase(SOD)activity and lactate dehydrogenase(LDH)leakage in cell culture supernatant were detected by ultraviolet spectrophotometry.Intracellular superoxide anion and apoptosis proportion were measured by flow cytometry.ResultsFollowing the increasing of H2O2concentration and the lengthening of the action time,cell viability and SOD activity decreased.Meanwhile,LDH leakage,apoptosis proportion andintracellular superoxide anion production increased.When treated with 250μmol/L H2O2for 4 hours, SOD activity significantly decreased(P＜0.05),apoptosis proportion and intracellular superoxide anion production significantly increased compared with the control group(P＜0.05).However,the increase of LDH leakage was not that significant(P＞0.05),and cell viability could reach to 85.13%in the above-mentioned condition.ConclusionsThe most appropriate condition of establishing the oxidative stress model of HTR-8/SVneo is treatment with 250μmol/L H2O2for 4 hours.

human trophoblastic cells； HTR-8/SVneo； hydrogen peroxide(H2O2)； oxidative stress； proliferation； apoptosis

R 71

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.01.007

2013-03-02；编辑：张秀峰)

国家自然科学基金(81000278)

△Corresponding author E-mail：xiaotianli555@163.com

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(81000278).