张占龙,宋永鸿,李 敏,李梅霞

(1.青海省化隆县畜牧局，青海 化隆 810900;2.青海省动物疫病预防控制中心，青海 西宁 810003；3.青海省贵南县过马营乡畜牧兽医站,青海 贵南 813101)

我国猪瘟疫苗效力检验的替代方法研究与应用进展

张占龙1,宋永鸿2,李 敏3,李梅霞2

(1.青海省化隆县畜牧局，青海 化隆 810900;2.青海省动物疫病预防控制中心，青海 西宁 810003；3.青海省贵南县过马营乡畜牧兽医站,青海 贵南 813101)

我国兽药典中现行的猪瘟疫苗效力检验方法存在试验成本较高、周期较长、操作较繁琐、重复性较差、敏感性较低等缺点，随着分子生物学与免疫学技术的日臻发展与应用，猪瘟疫苗效力检验的新兴替代检验方法不断发展和完善。论文就我国近年来针对猪瘟疫苗毒种、半成品、成品效力检验的新兴分子生物学和免疫学检测方法的研究与应用进展做一简要综述，旨在为提升我国猪瘟疫苗效力检验水平提供合理的科学依据。

猪瘟疫苗；效力检验；替代方法；研究与应用

猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的一种高度接触性、致死性的猪传染病。猪瘟在世界范围内流行，每年给全球养猪业带来了巨大的经济损失[1-2]，该病被世界动物卫生组织列为A类烈性传染病，被我国农业部列为一类动物疫病，是目前阻碍着我国养猪业的健康发展的首要动物疫病[3-4]。我国采用猪瘟兔化弱毒疫苗(C株)强制免疫接种为主要防治措施，使猪瘟在我国得到了有效控制，猪瘟频发的大流行状况已得到根除[5]，但近年来，我国猪瘟疫苗免疫失败的病例逐渐增多，周期性、波浪式的地区散发性流行日益严重[6]。导致疫苗免疫失败的原因很复杂，除了免疫程序不合理、母源抗体的干扰等原因外,疫苗效力达不到要求是其中一个重要原因[7]。由于猪瘟病毒不易产生细胞病变，因此兽药典中对其抗原病毒含量或疫苗效力检验主要依靠家兔或猪进行动物试验[8]，因用猪进行检验成本太高、试验操作难度太大、周期太长，故在生产实际中多采用兔体定型热反应方法，该方法仍然存在试验周期较长、操作较繁琐、重复性较差、敏感性较低等缺点，且受试验动物的个体差异、环境因素等多方面原因影响，检测结果不是十分准确。随着分子生物学与免疫学技术的日臻发展与应用，猪瘟疫苗效力检验的新兴替代检验方法不断发展和完善。本文就我国近年来针对猪瘟疫苗毒种、半成品的效价检验和成品疫苗效力检验的新兴分子生物学和免疫学检测方法的研究与应用进展做一简要综述，为提升我国猪瘟疫苗效力检验水平提供合理的科学依据。

1 qRT-PCR方法

qRT-PCR方法可以对猪瘟病毒核酸含量进行准确定量，与兔体定型热反应方法相比，具有快速、敏感、高通量和实时等优点，为猪瘟疫苗毒种、半成品、成品中病毒含量的测定提供了新的技术方法。Lin等[9]应用qRT-PCR方法对猪瘟培养细胞中的病毒含量进行实时监测，qRT-PCR方法较免疫荧光方法具有更高的敏感性，且检测快速、定量准确，可以将其用于猪瘟毒种与半成品的生产中确定最佳收毒时间，从而提高猪瘟疫苗质量。陈锴等[10]建立的定量检测猪瘟兔化弱毒疫苗病毒核酸含量的qRT-PCR方法仅能扩增猪瘟兔化弱毒疫苗株，最低可检测到4.35个cDNA拷贝量，该方法与兔体定型热反应同时对4个厂家17个批次的34份猪瘟疫苗进行效力检验，二者表现出了良好的相关性。葛叶等[11]采用qRT-PCR方法与兔体定型热反应对5份猪瘟兔化弱毒细胞苗成品和6份半成品样品进行平行检测，结果表明qRT-PCR方法检测结果中最低105个病毒拷贝可以使家兔产生定型热反应，最低103个病毒拷贝可以使家兔产生轻热反应，qRT-PCR方法的检测过程仅需3.5 h，大大缩短了猪瘟疫苗的检测时间，可以补充传统的兔体定型热反应用于猪瘟兔化弱毒疫苗半成品与成品的检验。韩文等[12]利用qRT-PCR方法对278批次猪瘟疫苗进行效力检验，有66批次(24 %)疫苗病毒含量达不到兽药典要求标准，抽取其中6份采用兔体定型热试验进行验证，两种检验方法的结果完全一致，表明qRT-PCR方法可以作为评价猪瘟疫苗质量的一种替代方法。总之，qRT-PCR检测方法可以替代传统的兔体定型热试验用于疫苗生产过程中的毒种、半成品的病毒含量测定，进而指导疫苗的配制，也可以用于猪瘟成品疫苗的效力检验，可成为实验室和猪瘟疫苗生产企业等进行猪瘟疫苗效力检验的敏感、准确和快速的替代检验方法。

2 RT-LAMP方法

环介导等温扩增(Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP)方法操作简单、无需特殊仪器设备、肉眼判读，特别适合基层实验室应用。Zhang等[13]根据CSFV NS5B 基因序列，利用在线软件Primer Explorer V4设计了针对CSFV兔化弱毒疫苗株的一套RT-LAMP引物，建立了可视化检测猪瘟兔化弱毒疫苗株的RT-LAMP方法，该方法65 ℃恒温反应1 h 即可完成扩增过程，检测CSFV-强毒株、BVDV、PRRSV、PRV、TGEV、PPV、PEDV、PCV-2、PrV均为阴性，检测灵敏度与qRT-PCR方法相当，均达到5个拷贝，应用RT-LAMP 方法和qRT-PCR方法对15个厂家生产的39个批次的58份市售猪瘟活疫苗的病毒核酸进行了检测分析，58份疫苗中有46份经两种方法检测均为阳性，二者的符合率达100 %。RT-LAMP方法快速、简单、灵敏、无需特殊仪器设备，但该方法只能根据检测结果的浑浊度进行病毒含量的定性检测，以及阴性、弱阳性、中阳性和强阳性的半定量检测，还无法实现qRT-PCR方法对病毒含量的实时定量跟踪检测，故其适合用于试验条件一般的基层实验室。

3 ELISA方法

ELISA方法即可用于测定抗原，也可用于测定抗体，具有灵敏、特异、快速、高通量及易于操作等优点，在猪瘟抗原病毒含量的测定和猪瘟抗体效价的测定中得到了广泛开发应用。在抗原定量检测方面，唐红慧等[14]应用进口猪瘟抗原/血清ELISA试剂盒对已做过兔体定型热反应和qRT-PCR检测的8个批次猪瘟成品细胞苗和13个批次猪瘟成品脾淋苗进行抽检测定其抗原含量，ELISA方法可检出20头份/瓶(或者109个病毒拷贝数/瓶)及以上的成品疫苗；该试剂盒和兔体定型热反应测定4个批次24份HCLV半成品细胞苗的抗原含量，二种方法的符合率高达95.8 %，但该方法无法区分猪瘟病毒抗原与牛流行性腹泻病毒抗原。肖锋等[15]研究也表明进口猪瘟抗原/血清ELISA试剂盒能够稳定、快速、简单地用于CSFV病毒含量测定。猪瘟ELISA抗原定量检测方法能够稳定、快速、简单地用于猪瘟细胞苗的半成品与成品的病毒含量测定，帮助筛选疫苗生产过程中不同滴度的病毒液，确定最佳收毒时间和阶段，为猪瘟疫苗生产和质量控制提供了一种准确和稳定的定量检测方法。在抗体效价测定方面，李娇等[16]建立了猪瘟抗体的PPA-ELISA检测方法，该方法以辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白(SPA)为二抗，SPA能与猪、兔等哺乳动物血清IgG的Fc段结合，使该方法可应用猪瘟疫苗免疫后的猪、兔血清抗体效价检测。蒋卉等[17]采用IDEXX商品化的猪瘟抗体ELISA检测试剂盒和兔体定型热反应进行猪瘟疫苗效力检验，兔体定型热反应与ELISA抗体检测结果具有较高的正相关性，两者符合率达95.83%。虽然ELISA抗体检测方法依然采用家兔进行效力检验，但省去了兔体定型热反应方法中每6 h进行1次家兔测温工作的繁琐操作，且可以有效地排除体温检测中轻热反应和可疑反应带来的不确定性，从而提高检验工作的效率和检验结果的准确性。

4 IFA方法

间接免疫荧光(Indirect Immunofluorescence Assay，IFA)方法是将免疫学方法与荧光标记技术结合起来研究特异性抗原在细胞内分布的方法，在荧光显微镜下，荧光素受激发光的照射可发出明亮的荧光，从而完成对抗原的定位以及抗原含量的定量。李晶梅等[18]使用韩国JBT公司猪瘟单抗作为一抗，荧光素标记羊抗鼠IgG为二抗，建立了检测猪瘟兔化弱毒的病毒含量(TCID50)的IFA方法，并与兔体反应热法进行了比较，证明两者存在一定平行关系，但IFA方法比兔体反应热法检测结果的数值低1个数量级左右，IFA方法与兔体定型热反应之间的正向关系使IFA成为猪瘟疫苗效力检验的替代方法成为可能。随后，戴志红等[19]以猪瘟病毒抗体(兔源)为一抗、荧光素标记羊抗兔IgG为二抗，建立了定量检测CSFV兔化弱毒株的IFA方法，该方法检测CSFV兔化弱毒株接种的PK细胞为阳性，而检测PRV、PPV、BVDV接种的PK细胞均为阴性，并探索得到了IFA方法测定的TCID50与兔体定型热反应测定的家兔体感染量(RID)之间的数量关系公式：1 RID/mL=(TCID50/0.1 mL+200)/12，IFA方法可作为猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检验的体外替代检验方法。IFA方法与兔体定型热反应方法相比，具有快速、特异、稳定等优点，但该方法仍需要采用细胞培养病毒，与ELISA方法相比，试验难度较高，操作较复杂，检验耗时较长。

5 胶体金检测方法

胶体金检测技术是一种新兴的免疫检测技术，具有方便快速、操作简单、灵敏度高、特异性强、无需特殊仪器等优点，同ELISA方法一样可用于测定猪瘟抗原病毒含量和猪瘟抗体效价。杨明等[20]、李华玮等[21]先后建立了检测猪瘟病毒抗原和猪瘟抗体的胶体金试纸条，将待测样品加入试纸条的加样孔内，20 min内就可以检测出是否带有猪瘟抗原或猪瘟抗体，同时还可以根据试纸条的颜色深浅将检测结果分为阴性、弱阳性、中阳性和强阳性，从而判定猪瘟抗原病毒含量的多少或猪瘟抗体效价的高低，但目前胶体金检测方法仅能够进行定性和半定量检测，还无法达到qRT-PCR方法和ELISA方法的定量监测分析，且胶体金检测技术只停留在了对临床病料中猪瘟抗原和抗体的检测，还未见将其应用于猪瘟疫苗效力检验中的报道，随着胶体金检测技术不断开发与应用，其在猪瘟疫苗效力检验中将会有广阔的应用价值。

6 结 语

我国研制的猪瘟兔化弱毒疫苗株(C株)的安全性和免疫效力毋庸置疑，但在临床生产应用中的猪瘟弱毒疫苗有的不是正规厂家生产的，有的未经过严格检验，有的达不到规定效价，造成了临床中的免疫失败。加强猪瘟疫苗的质量控制是猪瘟综合防控的重要步骤，而快速准确的检测猪瘟毒种、半成品、成品疫苗中的病毒含量是生产合格疫苗的有效保证。在猪瘟疫苗效力检验的这些分子生物学与免疫学新兴替代检验方法中qRT-PCR方法和ELISA方法定量准确，是猪瘟疫苗效力检验的首选替代方法，但qRT-PCR方法对仪器设备和操作人员要求均较高，基层实验室和一般猪瘟疫苗生产企业由于不具备试验条件很难展开；ELISA方法操作简单、检测快速，且高通量，非常适合大批量样品的检测，适合一般实验室应用，将具有广阔的开发应用前景；IFA方法需要进行细胞培养,操作较繁琐，且不能准确定量，在应用上受到一定的限制；RT-LAMP和胶体金方法均无需特殊仪器设备、肉眼判读，操作简单、检测快速，特别适合基层兽医实验室应用，但这2种检测方法目前只能实现定性和半定量检测。相信随着分子生物学和免疫学技术的进一步开发与应用，我国猪瘟疫苗的这些效力检验方法必将会不断发展和完善，逐步上升为国家法定标准，从而全面提高我国猪瘟疫苗效力检验水平，保障我国猪瘟疫苗质量。

[1]Feliziani F,Blome S,Petrini S,et al.First assessment of classical swine fever marker vaccine candidate CP7_E2alf for oral immunization of wild boar under field conditions[J].Vaccine,2014,32(18):2 050-2 055.

[2]Blome S,Gabriel C,Beer M.Possibilities and limitations in veterinary vaccine development using the example of classical swine fever[J].Berl Munch Tierarztl Wochenschr,2013,126(11-12):481-490.

[3]杨小燕,刘建奎,魏春华,等.猪瘟病毒福建野毒分离株FJ-1E2基因序列分析[J].动物医学进展,2013,34(8):46-50.

[4]Sun S Q,Yin S H,Guo H C,et al.Genetic typing of classical swine fever virus isolates from China[J].Transbound Emerg Dis,2013,60(4):370-375.

[5]Shen H Y,Wang J Y,Dong X Y,et al.Genome and molecular characterization of a CSFV strain isolated from a CSF outbreak in South China[J].Intervirology,2013,56(2):122-133.

[6]陈国花.猪瘟免疫失败原因分析及对策措施[J].中国畜牧兽医文摘,2014,30(1):91.

[7]仇华吉,童光志,沈荣显.猪瘟兔化弱毒疫苗-半个世纪的回顾[J].中国农业科学,2005,38(8):1 675-1 685.

[8]中国兽药典委员会．中华人民共和国兽药典[M].2010年版.北京:中国农业出版社,2011.

[9]Lin Y C,Wu S C,Yang M Y,et al.Application of real-time quantitative polymerase chain reaction to monitoring infection of classic swine fever virus and determining optimal harvest time in large-scale production[J].Vaccine,2013,31(47):5 565-5 571.

[10]陈 锴,姚华伟,王长江,等.q PCR作为猪瘟兔化弱毒疫苗效价检验替代方法的研究与应用[J].中国农业科学,2013,46(1):162-169.

[11]葛 叶,张兴娟,朱庆虎,等.qRT-PCR方法与兔体定型热试验对于检测猪瘟兔化弱毒疫苗的平行关系[J].中国预防兽医学报,2011,33(9):699-703.

[12]韩 文,王 楠,张兴娟,等.应用定量RT-PCR对猪瘟兔化弱毒疫苗的质量评价研究[J].中国预防兽医学报,2012,34(6):464-467.

[13]Zhang X J,Han Q Y,Sun Y,et al.Development of a loop-mediated isothermal amplification for visual detection of the HCLV vaccine against classical swine fever in China[J].J Virol Methods,2011,171(1):200-205.

[14]唐红慧,杜希珍,刘大伟,等.应用猪瘟抗原/血清ELISA测定猪瘟兔化弱毒疫苗中的病毒含量[J].金陵科技学院学报,2010,26(4):73-78.

[15]肖 锋,张松柏,蔡文杰,等.应用ELISA与PCR方法测定猪瘟弱毒疫苗中的抗原含量[J].湖南畜牧兽医,2013(5):9-11.

[16]李 娇,王金良,祖立闯,等.猪瘟病毒重组E2蛋白PPA-ELISA抗体检测试剂盒的研制及应用[J].中国兽医学报,2011,31(10):1 390-1 394.

[17]蒋 卉,戴志红,王在时,等.猪瘟兔化弱毒疫苗效力检验替代方法研究I家兔效力检验ELISA方法初探[J].中国兽医杂志,2013,49(5):9-12.

[18]李晶梅,朱 薇,秦红刚,等.IFA和IPMA方法测定猪瘟兔化弱毒病毒含量[J].中国兽药杂志,2013,47(10):35-38.

[19]戴志红,蒋 卉,李 翠,等.用间接免疫荧光检测方法评价猪瘟兔化弱毒活疫苗效力的研究[J].中国兽药杂志,2014,48(1):34-37.

[20]杨 明,陈伯祥,孙晓林,等.猪瘟胶体金快速诊断试纸条的研制[J].甘肃农业大学学报,2010,45(2):34-37.

[21]李华玮,郑 鸣.胶体金免疫层析法检测猪瘟(强弱毒区分)抗体研究[J].广东农业科学,2012,39(7):130-132.

ProgressinResearchandApplicationofAlternativeMethodsforEffectiveTestofClassicalSwineFeverVaccineinChina

ZHANG Zhan-Long1,SONG Yong-Hong2,LI Ming3,LI Mei-Xia2

(1.HualongCountyBureauofAnimalHusbandry,Hualong,Qinghai810900,China;2.QinghaiProvincialAnimalDiseasePreventionandControlCenter,Xining,Qinghai810003,China;3.GuomaTownshipAnimalHusbandryandVeterinaryStation,Guinan,Qinghai813101,China)

The current swine fever vaccine efficacy test methods in China's Veterinary Pharmacopoeia have the disadvantages of high cost,long cycling period,complex operation,poor repetition,and low sensitivity.With the application of molecular biology and immunology technology,the alternative test methods for classical swine fever vaccine potency test have undergone continuous development and improvement.This paper briefly reviewed the progress in research and application of classical swine fever vaccine,semi-finished products,new molecular biological and immunological detection methods for testing the effectiveness of the product in China in recent years,aiming to provide a reasonable scientific basis for enhancing the classical swine fever vaccine potency test level in China.

classical swine fever vaccine; efficacy test; alternative methods; research and application

2014-04-17，

2014-05-01

张占龙(1978-)，青海化隆人，本科，研究方向：疾病预防和控制。E-mail:zhangzhanlong1978@qq.com

S811.6

A

1005-5228(2014)08-0086-04