钟小仙，刘智微，刘伟国，崔莉莉，吴娟子，张建丽

（江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏 南京210014）

狼尾草属（Pennisetum）隶属于禾本科，全世界约有130个种，广泛分布于热带、亚热带和部分温带地区，一年生二倍体美洲狼尾草（Pennisetumamericanum；2n＝2x＝14，AA）和多年生四倍体象草（P.purpureum；2n＝4x＝28，AABB）是其中最重要的2个种［1］。美国乔治亚州立大学Tifton试验站自20世纪40年代开始杂交狼尾草品种选育［2］，利用美洲狼尾草不育系与象草恢复系远缘杂交获得了三倍体杂交狼尾草，能综合母本美洲狼尾草品质优和父本象草产草量高、抗逆性强、可多年生的特性［3－4］。杂交狼尾草不仅可作为草食畜禽的优质青饲料，优质纸浆和人造板原料，还是重要的生物质能源作物［5－8］。但由于父本象草为光周期敏感型短日照作物，自然开花期在美国大部分地区因霜冻危害，无法完成大面积杂交制种或种子产量极低，Tifton试验站迄今尚未实现商品化种子生产。通过秋水仙素处理进行染色体加倍、结合集团选择或回交选育能种子繁殖、综合农艺性状优良的六倍体或四倍体杂交狼尾草，被认为是一种恢复杂交狼尾草育性和进行商品化种子生产的可能途径，美国、巴西、印度等国已取得了初步的进展［9－12］。江苏农业科学院20世纪80年代从美国引进了杂交狼尾草品种及其亲本材料，经过多年的系统研究，尽管建立了“人工短日照处理诱导象草开花并与美洲狼尾草不育系花期相遇”制种体系，率先突破了北纬26°以北地区不能杂交制种的生态禁区，但近年来灾害性天气发生频繁，父母本花期相遇不稳定，制种产量低、风险大［13－14］，亟需尝试杂交狼尾草大面积商品化种子生产的其他途径，特别是耐盐“苏牧2号”象草2010通过全国牧草品种审定后［15］，创造耐盐六倍体杂交狼尾草新种质，并与美洲狼尾草杂交选育四倍体耐盐杂交狼尾草成为近期育种的又一目标。

本文以六倍体杂交狼尾草体细胞突变体CHP2009－14为材料，耐盐杂交狼尾草（美洲狼尾草Tift23A×苏牧2号象草）为对照，通过综合农艺性状评价和饲用价值比较、叶片微形态特性分析和流式细胞术鉴定，以期明确六倍体耐盐杂交狼尾草新种质的特异性，为四倍体杂交狼尾草新品种选育提供参考，有关研究国内尚未见报道。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

大田试验在大丰市金海农场试验基地进行。试验地土壤为轻质沙壤，有机质、碱解氮、速效磷含量分别为16.8g/kg，31.2mg/kg，22.35mg/kg，pH 8.1，含盐量为3.6g/kg。

1.2 试验材料

杂交狼尾草（CK）：美洲狼尾草不育系Tift23A×苏牧2号象草，2n＝3x＝21，为三倍体；CHP2009－14：2007年，以对照杂交狼尾草幼穗离体培养获得的胚性愈伤组织为材料，经500mg/L秋水仙素诱导72h获得的体细胞突变体，2n＝6x＝42，为六倍体耐盐杂交狼尾草体细胞突变体。

1.3 试验方法

1.3.1 体细胞再生植株大田综合农艺性状评价和营养品质分析 2011年5月10日，把冬季塑料大棚保存的CHP2009－14和对照杂交狼尾草种茎移栽至大田，畦宽4m，行株距为45cm×40cm，每小区10行，每行8株，小区面积为16m2，随机区组设计，3次重复。移栽前施无机复合肥（N∶P∶K＝10∶8∶7）750kg/hm2作基肥，苗期追施尿素75kg/hm2。

2011年8月1日，对植株综合农艺性状进行定性观察后，每个小区随机选取5株测量株高（从地面至植株的最高部位的绝对高度），计算其平均值；每个小区各随机选取10株，测量主茎倒数第3张完全展开叶的长度和宽度，计算平均值；选取叶片中间区域、主脉左右厚度均匀的部位，打孔器取叶片小样，用游标卡尺测量20片小样的中心处厚度，计算其平均值，并测定叶片叶绿素含量［16］；选取中间8行进行刈割测产，刈割留茬高度为15cm，取约1kg样品茎叶分离后，75℃烘干测定含水量，计算干物质产量，并进行营养品质分析，粗蛋白、酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维、粗灰分的测定参照Van Soest纤维测定法［17］，体外干物质消化率（IVDMD）采用Goto胃蛋白酶－纤维素酶两步消化法测定［18］，刈割后田间统计中间6行植株的平均分蘖数。

1.3.2 叶片表皮微形态结构分析 2011年7月28日，每个小区分别选取2个供试材料各1株，切取其倒数第3张完整叶片的中间区域（长1cm、宽为叶片自然宽度），浸泡在30%过氧化氢∶醋酸（v∶v＝1∶1）溶液中，在60℃烘箱内放置2～4h，待叶肉组织和表皮细胞分离后取出，放入装有适量蒸馏水的培养皿中，用镊子分离叶片上、下表皮，1%番红染色3～6min，制成临时装片，在OLYMPUS CX31光学显微镜下观察并拍照。采用形态学（荧光）图像分析系统1.0软件（JD801，江苏捷达软件工程有限公司，南京）测量如下各项指标。

气孔器密度：在10×10倍的物镜下，每份材料选择30个清晰视野拍照，计数气孔器数目，测量视野中表皮面积，计算密度。

气孔器长度、宽度及面积：在10×40倍物镜下，每份供试材料选取15个视野，每个视野随机测量2个气孔器的长度、宽度和面积。由于取样后气孔处于关闭的状态，试验测得的气孔器长度和宽度是指气孔关闭状态下哑铃型气孔器的长度、宽度以及面积［19］。

1.3.3 流式细胞术分析 2011年8月5日，各小区选取供试材料各1株刈割后再生的幼嫩叶片20～30mg，用刀片迅速切碎，放入加有1mL LB01缓冲液（15mmol/L Tris－HCl，2mmol/L Na2EDTA，80mmol/L KCl，20 mmol/L NaCl，0.5mmol/L spermine，15mmol/L mercaptoethanol，0.1%Triton X－100，pH 9.0）的培养皿（培养皿置于冰袋上）中，用移液枪将混合液吸打2～3次，经二层400目（38μm）尼龙网过滤，滤液收集至1.5mL的离心管中，4℃、2000r/min离心3min，弃上清液，加入200μL LB01缓冲液，轻轻振荡细胞重新悬浮，加入25μL的碘化丙啶（1mg/mL）进行染色，并加入5μL RNase（1mg/mL），4℃、避光染色约1h后，转入标准上样管中，采用美国BD公司的FACSCalibur流式细胞仪进行测定，使用随机软件Cellquest Pro获取数据，采用Flowjo 7.5软件做细胞周期分析。

1.4 数据分析

利用Excel 2003软件进行数据统计，SPSS 16.0软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 综合农艺性状评价和品质分析

与对照三倍体杂交狼尾草相比，六倍体新种质CHP2009－14株型紧凑，叶色深绿，叶绿素含量比对照提高10.51%（P＜0.05），叶片变短变厚，茎节缩短，叶片和叶鞘上绒毛增多，花药无花粉散出，联苯胺－过氧化氢反应液能将CHP2009－14的白色柱头染成深蓝色并伴有大量气泡出现，表明柱头具有可授性。六倍体杂交狼尾草新种质CHP2009－14的株高与对照三倍体杂交狼尾草相比降低了26.34% （P＜0.01），叶片长度减少了20.06%（P＜0.01），叶片厚度增加了16.41% （P＜0.01），茎叶比减少了43.61% （P＜0.01），分蘖数提高44.62% （P＜0.01），叶片宽度CHP2009－14与对照差异不显著（表1）。

与对照三倍体杂交狼尾草相比，六倍体杂交狼尾草新种质CHP2009－14体外消化率显著提高6.94% （P＜0.05），粗蛋白含量和灰分含量分别极显著提高62.34% （P＜0.01）和17.35% （P＜0.01），中性洗涤纤维含量和酸性洗涤纤维含量分别降低3.35% （P＞0.05）和提高0.50% （P＞0.05），差异不显著。六倍体杂交狼尾草新种质CHP2009－14的鲜草产量比对照提高0.87% （P＞0.05），但由于六倍体杂交狼尾草新种质植株的含水量低于对照，干物质产量比对照低3.27% （P＞0.05），差异均未达到显著水平（表2）。

表1 六倍体CHP2009－14与三倍体杂交狼尾草（CK）生物学特性比较Table 1 Comparison of biological characteristics in hexaploid CHP2009－14and triploid hybrid Pennisetum

表2 六倍体新种质CHP2009－14与三倍体对照杂交狼尾草生物产量和品质比较Table 2 Comparison of biomass and animal nutrition in hexaploid CHP2009－14and triploid hybrid Pennisetum

2.2 叶片表皮微形态特异性分析

杂交狼尾草新种质CHP2009－14与对照叶片上、下表皮均由气孔器、长细胞（L）、短细胞（S）、叶脉和刺毛（T）等组成，脉间长细胞多为长形，细胞壁多具齿纹，短细胞及气孔器分布于长细胞间，气孔器成行分布于叶脉间隙（图1）。

与对照三倍体杂交狼尾草相比，六倍体杂交狼尾草新种质CHP2009－14上表皮气孔器密度减小了65.20%（P＜0.01），气孔器长度和宽度分别增加了47.71%（P＜0.01）和51.54%（P＜0.01）；下表皮气孔器密度减小了35.71%（P＜0.01），其气孔器长度和宽度分别增加了30.53%（P＜0.01）和34.17%（P＜0.01）；杂交狼尾草新种质CHP2009－14叶片上、下表皮气孔器面积均较对照杂交狼尾草有所增加，分别达到对照杂交狼尾草气孔器面积的2.07倍和1.54倍（表3）。

图1 CHP2009－14与三倍体杂交狼尾草叶片上下表皮气孔特性比较Fig.1 Comparison of stoma characteristics in upper and lower leaf epidermis of CHP2009－14and triploid hybrid Pennisetum

表3 六倍体CHP2009－14与三倍体杂交狼尾草叶片表皮气孔器特征Table 3 Stoma characteristics in upper and lower leaf epidermis of CHP2009－14and hybrid Pennisetum

2.3 流式细胞术分析

以三倍体杂交狼尾草为对照，调整仪器阈值使对照三倍体杂交狼尾草G1期峰值所在的荧光道数为200道，检测三倍体杂交狼尾草和六倍体杂交狼尾草新种质CHP2009－14植株细胞核的DNA相对含量。结果显示（图2），三倍体杂交狼尾草G1期峰值位于200道附近，G2期峰值位于400道附近；新种质CHP2009－14植株的G1、G2期峰值分别位于400道和800道附近，表示其细胞核DNA含量为对照三倍体杂交狼尾草的两倍，杂交狼尾草新种质CHP2009－14的染色体与对照相比发生了加倍。

3 讨论与结论

3.1 六倍体杂交狼尾草种质创新及评价

图2 杂交狼尾草体细胞突变体对照 （A）和CHP2009－14（B）叶片相对DNA含量分布曲线Fig.2 Distribution curve of relative DNA content of somatic mutant CK （A）and CHP2009－14（B）in leaf

多年来，人工诱导多倍体的研究一直吸引着广大的植物育种工作者［20］。但大量的研究发现，多倍化的种质在形态、细胞学特性和分子特性方面发生的变异是多样而复杂的［21－22］，人工诱导六倍体杂交狼尾草的研究国外有少量报道。Rajasekaran等［23］以不育系Tift23DA（2n＝2x＝14）×矮生象草品种‘N75’（2n＝4x＝28）杂交种幼穗为外植体，离体培养获得的胚性愈伤为材料，在适宜激素组合的培养基中继代和分化培养后的再生植株中，获得了2株可自交结实的突变体植株，经根尖染色体计数分析，染色体数2n＝6x＝42，为六倍体杂交狼尾草突变体植株，但对突变体产生机理尚不清楚，推测可能原始外植体为嵌合体，也可能与组织培养过程有关，对2个可自交结实的六倍体杂交狼尾草突变体的植物学特征评价表明，2个六倍体杂交狼尾草株高均极显著低于对照三倍体杂交狼尾草，叶片宽度大于等于对照，而叶片长度表现不一，1个比对照长，1个比对照短。Hanna［10］利用秋水仙素处理三倍体杂交狼尾草幼苗根获得了可自交结实的六倍体杂交狼尾草，Hanna等［24］对狼尾草属次级基因库中向初级基因库中遗传物质转移的研究表明，以雌雄蕊均可育的六倍体杂交狼尾草为母本或父本与美洲狼尾草杂交均可产生种子，实现次级基因库中的象草遗传物质向美洲狼尾草转移。本研究中的六倍体杂交狼尾草新种质CHP2009－14，是以三倍体杂交狼尾草（Tift 23A×苏牧2号象草）的幼穗为材料，离体培养获得的胚性愈伤为外植体，在继代培养基中经500mg/L秋水仙素诱导处理72h，分化培养后获得的染色体加倍植株。与对照三倍体杂交狼尾草相比，株高极显著降低、叶片长度极显著减小、分蘖数和叶片厚度极显著增加，叶片宽度与对照无显著差异，茎叶比极显著减小；六倍体杂交狼尾草新种质CHP2009－14具有多年生习性，尽管花药败育，不能自交结实，但柱头具有可授性，正在筛选合适的二倍体美洲狼尾草恢复系与之杂交选育四倍体杂交狼尾草新品系，有关研究结果将进一步报道。

Hanna等［25］研究了倍性对杂交狼尾草产量和品质的影响，认为多倍体对产量和品质没有影响或有负面影响，三倍体杂交狼尾草比六倍体杂交狼尾草具有更高的产量和品质。本研究结果表明，在海涂地种植的新种质CHP2009－14鲜草产量略高于三倍体杂交狼尾草，干物质产量略低于对照，差异不显著，体外消化率显著增加，粗蛋白含量极显著提高。本试验结果与Hanna等［25］的研究结果不一致，分析原因可能与种植的土地类型有关，CHP2009－14在盐碱地种植表现优于三倍体杂交狼尾草，有关机理正在进一步研究。

3.2 六倍体杂交狼尾草新种质的鉴定方法

Hodgson等［26］提出在被子植物相当大范围的分类单元里气孔的大小与基因组大小呈正相关关系。Campos等［12］对获得的17株六倍体植株、115株嵌合体植株的气孔器特性分析表明，六倍体杂交狼尾草上下表皮气孔器密度比三倍体杂交狼尾草减小了大约48.83%和44.83%，气孔器面积约是三倍体杂交狼尾草的1.52倍，混倍体植株气孔器密度和大小介于三倍体和六倍体之间。本研究结果表明，上下表皮气孔器密度六倍体杂交狼尾草新种质CHP2009－14比三倍体杂交狼尾草减小65.2%和35.71%，CHP2009－14叶片上、下表皮气孔器面积分别为对照三倍体杂交狼尾草气孔器面积的2.07倍和1.54倍，与Campos等［12］的研究结果呈现相似的规律。尽管多倍体育种中根尖染色体计数是最直接的倍性鉴定证据，但由于染色体精确计数对操作技术要求极高［27］，对染色体数多的嵌合体不易识别，而流式细胞术可灵敏地检测出嵌合体并计算不同倍性细胞所占比例［28］。本研究中流式细胞术的分析结果表明，对照三倍体杂交狼尾草有丝分裂G1期和G2期的峰值在200和400附近，而CHP2009－14有丝分裂G1期和G2期的峰值在400和800附近，表明CHP2009－14细胞核DNA含量约是对照三倍体杂交狼尾草的2倍，与CHP2009－14的染色体计数结果2n＝42相吻合。因此，在秋水仙素诱导处理三倍体杂交狼尾草胚性愈伤再生植株后，可以先进行叶片气孔器特性分析初步筛选，然后进行流式细胞术分析，最后进行染色体计数确定，可提高六倍体杂交狼尾草新种质筛选的效率。

［1］ Walter R F，Henry H H.Hybridization of Crop Plants［M］.Wisconsin：American Society of Agronomy and Crop Science Society of America，1980.

［2］ Burton G W.Hybrid between napiergrass and cattail millet［J］.Journal of Heredity，1944，35（5）：726－732.

［3］ Powell J B，Burton G W.A suggested commercial method of producing an interspecific hybrid forage inPennisetum［J］.Crop Science，1966，6：378－379.

［4］ Rai K N，Chandra S，Rao A S.Potential advantages of male－sterile F1hybrids for use as seed parents of three－way hybrids in pearl millet［J］.Field Crops Research，2000，（68）：173－181.

［5］ Ekemini E O，Micheal E A，Godfrey A I.Forage potentials of interspecific hybrids between elephant grass selections and cultivated pearl millet genotypes of Nigerian origin［J］.Journal of Plant Breeding and Crop Science，2012，4（9）：136－143.

［6］ Madakadze I C，Masamvu T M，Radiotis T，etal.Evaluation of pulp and paper making characteristics of elephant grass（PennisetumpurpureumSchum.）and switchgrass （PanicumvirgatumL.）［J］.African Journal of Environmental Science and Technology，2010，4（7）：465－470.

［7］ 张德荣，母军，王洪滨，等.杂交狼尾草制造刨花板工艺研究［J］.北京林业大学学报，2008，30（3）：136－139.

［8］ Schank S C，Diz D A，Bates D B，etal.Genetic improvement of napiergrass and hybrids with pearl millet［J］.Biomass and Bioenergy，1993，5（1）：35－40.

［9］ Aken’ova M E，Chheda H R.Morphology，cytology and forage potential ofPennisetumAmericanum（L.）K.Schum.×P.purpureumSchum.Amphidiploids［J］.Euphytica，1981，（30）：397－404.

［10］ Hanna W W.Method of reproduction in napiergrass and in the 3Xand 6Xalloploid hybrids with pearl millet［J］.Crop Science，1981，21：123－126.

［11］ Diz D A，Schank S C.Characterization of seed producing pearl millet×elephantgrass hexaploid hybrids［J］.Euphytica，1993，67：143－149.

［12］ Campos J M S，Davide L C，Salgado C C.Invitroinduction of hexaploid plants from triploid hybrids ofPennisetumpurpureumandPennisetumglaucum［J］.Plant Breeding，2009，128：101－104.

［13］ 白淑娟，顾洪如，周卫星，等.杂交狼尾草制种技术［J］.江苏农业科学，1997，5：58－60.

［14］ 白淑娟，张运昌，陈德新.杂交狼尾草亲本花期及主要植物学性状［J］.中国草地学报，1996，3：49－52.

［15］ 马金星，张吉宇，单丽燕，等.中国草品种审定登记工作进展［J］.草业学报，2011，20（1）：206－213.

［16］ 魏海姗.植物生理学实验［M］.北京：科学出版社，1974.

［17］ 杨胜.饲料分析及饲料检测技术［M］.北京：北京农业大学出版社，1991.

［18］ Goto I，Minson D.Prediction of the dry matter digestibility of tropical grasses using apepsin－cellulase essay［J］.Animal Feed science and Technology，1997，（2）：247－253.

［19］ 云岚，云锦凤，李俊琴，等.新麦草愈伤组织多倍体诱导与倍性鉴定［J］.草业学报，2010，19（6）：126－131.

［20］ 刘曙娜，于林清，周延林，等.利用RAPD技术构建四倍体苜蓿遗传连锁图谱［J］.草业学报，2012，21（1）：170－175.

［21］ 聂利红，王延召，房卫平，等.多倍体植物基因组结构和基因表达的变化研究进展［J］.河南农业科学，2012，41（2）：1－4.

［22］ 徐远东，范彦，何玮.多倍体育种在牧草和草坪草中的应用［J］.牧草科学，2012，（9）：12－15.

［23］ Rajasekaran K，Schank S C，Vasil I K.Characterization of biomass production，cytology，and phenotypes of plants regenerated from embryogenic callus cultures ofPennisetumamericanum×P.purpureum（hybrid triploid napiergrass）［J］.Theoreti－cal and Applied Genetics，1986，73：4－10.

［24］ Hanna W W.Transfer of germ plasm from the secondary to the primary gene pool inPennisetum［J］.Theoretical and Applied Genetics，1990，80：200－204.

［25］ Hanna W W，Gaines T P，Gonzalez B，etal.Effect of ploidy on yield and quality of Pearl millet×Napiergrass hybrids［J］.Agronomy Journal，1984，76：969－971.

［26］ Hodgson J G，Sharafi M，Jalili A，etal.Stomatal vs genome size in angiosperms：the somatic tail wagging the genomic dog［J］.Annals of Botany，2010，105：573－584.

［27］ 常盼盼，钟小仙，刘智微.海滨雀稗体细胞突变体SP2008－3的特异性分析［J］.草业学报，2012，21（6）：207－212.

［28］ Galbraith D W，Harkins K R，Maddox J M，etal.Rapid flow cytometric analysis of the cell cycle in intact plant tissues［J］.Science，1983，220：1049－1051.