何明雄, 吴 波, 谭芙蓉, 王景丽, 税宗霞, 秦 晗, 代立春, 胡启春

1.农业部沼气科学研究所, 生物质能技术研究中心, 成都 610041;

2.农业部农村可再生能源开发与利用重点实验室, 成都 610041

当前人类社会发展迅猛，同时面临全球环境恶化、能源短缺和资源匮乏等三大危机的严峻挑战。在这种形势下，开发清洁的可再生能源已成为全球能源与环境领域的一个紧迫课题。我国能源形势非常严峻，据《2013年国内外油气行业发展报告》(中国石油集团经济技术研究院)，2013年中国原油进口量约为2.89亿t，中国对外原油依存度达到了58.1%，到2020年中国石油对外依存度很有可能上升至66%，解决能源替代问题成为关乎国民经济可持续发展的战略性问题。

我国的纤维素类生物质原料非常丰富，据2011年1月21日农业部发布的《全国农作物秸秆资源调查与评价报告》显示：我国农作物秸秆可收集资源量约为7亿t。将这些资源转化为燃料乙醇或其他生物基材料具有很大的潜力。当前，以生物能源、生物基产品等为主要内容的生物质产业，不仅是拓展农业功能、促进资源利用的战略性新兴产业，也对减轻我国农业生态环境污染和经济社会发展等具有重要的战略意义和现实意义。

虽然国内已经在生物质能源领域已进行了大量的有益探索和尝试，取得了一些进展，研究领域涉及生物质资源原料学(如秸秆等农业废弃物资源、能源植物等)、预处理技术、发酵过程优化与控制、高值化利用技术(如生物燃气发电、生物燃气车用燃料技术和车用液体燃料技术等)及环保处理技术(如沼液—沼渣生态循环利用模式等)等，初步形成了沼气化、固体及液体燃料化等能源利用技术模式。然而在纤维素生物质转化为燃料乙醇或其他生物基材料的过程中，尚存在大量未解决的关键科学问题，尤其是缺乏能够同时高效利用纤维素类水解物的发酵菌株，已成为纤维素生物质高效与高值转化的关键制约因素。

运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)是目前唯一一种通过ED(Entner-Doudoroff)途径厌氧发酵葡萄糖的微生物，其独特的代谢途径使其成为构建产乙醇工程菌的优选宿主之一；同时由于该菌具有较高的糖利用效率等优点，也是其他生物基化学品生产的重要候选平台微生物，如山梨醇、葡萄糖酸、丁二酸和异丁醇等。因此本文从运动发酵单胞菌的研究历程、分子生物学基础、菌种改良及该菌在生物能源及生物基化学品生物炼制体系中的应用研究进展进行了综述，以阐明该菌可作为纤维素生物质生物炼制系统的新的重要平台微生物。

1 运动发酵单胞菌的研究历程

1911年，Barker和Hiller[1]在变质的苹果酒中研究发现，一种特殊的细菌与其变质有关；1924年Lindner从龙舌兰酒中分离得到了运动发酵单胞菌[2]。20世纪50年代早期，人们发现运动发酵单胞菌在厌氧条件下主要通过ED途径代谢葡萄糖，它可以发酵葡萄糖、果糖和蔗糖等六碳糖产乙醇，但不能利用五碳糖生产乙醇。迄今为止，该菌是唯一一种通过ED途径厌氧发酵葡萄糖的微生物。自20世纪初分离得到该菌以来，研究者已在生态学、生理生化、分子生物学、菌株选育、发酵动力学、基因组测序、转录组学和蛋白质组学等方面做了大量的研究[3～8]。同酿酒酵母相比，运动发酵单胞菌具有如下优点：较高的糖吸收率、较高的乙醇产率、较少的生物量以及较高的乙醇耐受力等。但该菌底物利用范围过窄，一般野生型菌株只能以葡萄糖、果糖和蔗糖作为生产乙醇的底物，不能将复杂的碳水化合物代谢为乙醇。为拓宽其底物利用范围，研究者将其他微生物中相关的水解酶基因，如阿拉伯糖或者纤维素代谢的相关基因转移到该菌中，使其具有利用其他底物的能力[9]。随着2005年该菌全基因组序列的公布[10]和2006年杜邦公司宣布对该菌进行玉米秸秆燃料乙醇的研究[11]，其产业化应用前景值得我们关注。

2 运动发酵单胞菌的分子生物学基础及菌种改良

自20世纪80年代以来，研究者已就运动发酵单胞菌的遗传操作平台系统开展了大量的研究[9,12,13]，如野生型质粒、广谱宿主载体、穿梭质粒、表达系统、基因导入、启动子和报告基因等；同时在关键基因敲除、基因组学和转录组学等方面也开展了大量研究[14]。目前，已有7株运动发酵单胞菌菌株完成了基因组测序，包括ZM4(ATCC31821)[15]、NCIMB11163[16]、ATCC 10988[17]、ATCC 29191[18]、CP4(NRRL B-14023)[19]、ATCC 29192[20]和ZM401(ATCC 31822)[21]；同时，还对不同条件下的转录组学进行了研究，主要包括厌氧和好氧条件[22]、纤维素水解物抑制物(呋喃甲醛)[23]和乙醇[24,25]等。何明雄等[23,24]通过代谢分析及表达谱芯片等技术，首次比较了不同生理状态下环境胁迫因子对运动发酵单胞菌的生长抑制、葡萄糖代谢规律和基因表达谱的差异，揭示了这些抑制因子对运动发酵单胞菌代谢和基因转录的影响。在呋喃甲醛胁迫情况下，有433个基因的表达水平发生了变化，其中上调表达的基因216个，下调表达的基因217个；而在乙醇胁迫情况下，有127个基因的表达水平发生了变化，其中上调表达的基因89个，下调表达的基因38个。GO分析表明，这些基因涉及细胞膜、代谢、转录调控及未知功能等。因此，随着运动发酵单胞菌基因组序列的测定、基因注释的不断完善及代谢网络的日渐清晰，在功能基因组学、蛋白质组学、转录组学和代谢组学等层次的深入研究，将为理解并运用该菌的代谢、基因表达调控规律并且高效调控代谢物生产奠定理论基础[10,26]。

此外，构建和选育高效且具有高胁迫适应能力的发酵工程菌株是实现纤维素生物质高效和高值转化的关键因素。目前在运动发酵单胞菌的构建和选育等方面，国内外研究者已开展了大量的研究工作，获得了一些性能改进的工程菌株。主要采用的策略包括：传统的诱变育种[9]、转座子诱变技术[27～29]、适应性进化技术[30,31]和代谢工程技术等。

3 运动发酵单胞菌生产生物能源及生物基化学品

3.1运动发酵单胞菌生产燃料乙醇

运动发酵单胞菌在厌氧条件下主要通过ED途径代谢葡萄糖，它可以发酵葡萄糖、果糖和蔗糖等六碳糖产乙醇，但不能利用五碳糖生产乙醇。因此,在1995年以前，利用运动发酵单胞菌产乙醇的研究主要集中在以甘蔗、糖蜜、淀粉类和葡萄糖等为原料上，国内外研究者进行了广泛而深入的研究和系统评估，显示了较高的乙醇产率[2，9，12，13，32～35]。但基于食物安全等考虑，发展基于纤维素生物质为原料的燃料乙醇将是未来发展的趋势[36～38]，为了获得利用低成本原料(如纤维素、半纤维素和淀粉等)且乙醇产率高的运动发酵单胞菌菌株，研究者们已将其他微生物中五碳糖代谢途径相关基因或水解酶基因等转移到运动发酵单胞菌中，拓展该菌的底物利用范围。这些工作为进一步提高运动发酵单胞菌的乙醇生产性能提供了可能，也为未来的研究工作提供了很有益的经验。

目前，已构建获得多株具有木糖、阿拉伯糖等五碳糖利用能力的重组菌株，如，Z.mobilisCP4(pZB5)[39]、Z.mobilisCP4(pZB206)[40]、Z.mobilis206C(pZB301)[41]、Z.mobilisAX101[42]和Z.mobilisHYMX[29]等，这些菌株包括质粒复制型或基因组整合型运动发酵单胞菌工程菌株。同时，通过运动发酵单胞菌发酵不同的纤维素生物质原料生产乙醇，如玉米秸秆[43～45]、竹子[46]等，国内外均进行了大量的研究，积累了大量的发酵工艺数据，为运动发酵单胞菌利用纤维素生物质水解物发酵生产乙醇奠定了基础。

然而，生产纤维素乙醇需要多个步骤才能完成，主要包括预处理、酶解和发酵等。在预处理阶段，容易形成呋喃甲醛、乙酸等抑制微生物发酵的物质，因此，构建和选育具有高胁迫适应能力的菌株是一项艰巨的任务[23,24,47～49]。目前，已通过基因工程、适应性进化等方法获得了一些具有乙酸耐受性的重组运动发酵单胞菌，如Z.mobilisZM4/AcR(pZB5)[50]。

另外，由于发展CBP(consolidated bioprocessing)工艺是降低纤维素乙醇生物转化过程成本的有效手段[51，52]，国外研究者也尝试将纤维素水解相关酶基因直接转入运动发酵单胞菌中，以期获得具有直接发酵纤维素生物质产乙醇的“超级工程菌株”，Linger等[53]将来自嗜酸纤维素分解菌(Acidothermuscellulolyticus)的E1和GH12纤维素水解酶基因导入运动发酵单胞菌中，实现了活性表达；Thirumalai等[54]将来自素食昆虫消化道的5个纤维素水解酶基因在运动发酵单胞菌中进行表达，重组菌株能直接利用经过预处理的纤维素原料发酵产生乙醇；Kojima等[55]也将来自纤维单胞菌(Cellulomonasfimi)的6个纤维素水解酶基因(CenA，CenB，CenD,CbhA，CbhB和Cex)和来自白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)的2个纤维素水解酶基因 (cenA，bgl)在运动发酵单胞菌中进行表达。这些研究展示了运动发酵单胞菌作为一种新型的CBP平台微生物在纤维素乙醇生产中的潜力。

3.2运动发酵单胞菌联产山梨醇和生物酸

2013年，美国能源部公布了未来12种最具前景的生物炼制产品[56]，包括丁二酸(succinic)、反丁烯二酸(fumaric)、苹果酸(malic)、2，5-呋喃二羧酸(2，5-furan dicarboxylic acid，FDCA)、3-羟基丙酸(3-hydroxypropionic acid，3-HPA)、天门冬氨酸(aspartic acid)、谷氨酸(glutamic acid)、葡萄糖二酸(glucaric acid)、衣康酸(itaconic acid)、乙酰丙酸(levulinic acid)、3-羟基-γ-丁内酯(3-Hydroxybutyrolactone)，甘油(glycerol)，山梨醇(sorbitol)，木糖醇(xylitol)及阿拉伯糖醇(arabinitol)等。

山梨醇是美国能源部筛选的12个最具开发潜力的生物质来源的关键中间体之一，葡萄糖酸是最具开发潜力的30个关键中间体之一。从这两个关键中间体出发，可以得到多种在化学品生产和材料市场上具有广泛用途的中间产品。

1984年，Barrow等[57]研究发现，运动发酵单胞菌在以蔗糖、葡萄糖和果糖混合物为碳源时，其乙醇产率下降；进一步的研究发现，乙醇产率下降的原因是由于生成了副产物——山梨醇。随后，Leigh等[58]提出了山梨醇的合成代谢途径，Zachariou和Scopes[59]证实葡萄糖果糖氧化还原酶glucose-fructose oxidoreductase，GFOR) 和葡糖酸内酯酶(glucono-σ-gluconase，GL)负责山梨醇的生物合成。这些研究表明：运动发酵单胞菌可在GFOR的介导下，通过一步酶促反应实现山梨醇的生物合成，同时还可生成葡萄糖酸等副产品。基于这些研究，国内外研究者发展了游离酶、全细胞、渗透化处理细胞及固定化细胞等多种山梨醇生产工艺[60，61]。如Chun和Rogers[60]发展了一种山梨醇联产葡萄糖酸的工艺，在以300 g/L葡萄糖和300 g/L果糖为碳源的条件下，利用渗透化处理的细胞，发酵15 h后，山梨醇产量可达290 g/L，葡萄糖酸产量可达290 g/L，其产率接近理论产率的95%。尽管重组干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)[62]和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)[63]已被应用于生物山梨醇的合成研究，但其产率仅为0.65～0.67 mol/mol葡萄糖[64]，较运动发酵单胞菌低；运动发酵单胞菌具有特殊的山梨醇合成代谢途径、较高的糖利用效率，并能产生更高价值的副产物，因此，利用该菌联产山梨醇和葡萄糖酸是较具潜力的生物制造过程。但由于野生型菌株中葡萄糖果糖氧化还原酶的活性较低，且受葡萄糖浓度的调控，为改善山梨醇的合成效率，Liu等[65]利用基因工程技术，过表达葡萄糖果糖氧化还原酶，结合发酵工艺调节，进一步改善了山梨醇的产率。

有趣的是，Satory等[66]在研究GFOR的催化底物时发现：在果糖存在的条件下，该酶还可利用其他醛糖(aldose sugars)合成相应的醛糖酸(aldonic acid)，其转化率依糖的不同可达9%～84%。这表明有可能利用运动发酵单胞菌进行其他生物酸的合成，如乳糖酸(lactobionic acid，LBA)、麦芽糖酸(maltobionic)、木质酸(xylonic acid)、半乳糖酸(galactonic acid)、阿糖酸(arabinonic acid)、甘露酸(mannonic acid)和纤维素二糖酸(cellobionic acid)等。以乳糖酸为例，由于其在医药、食品和化工等行业中的广泛用途，Satory等[66]发展了一种利用果糖和乳糖混合物转化生成乳糖酸的完全混合反应器(continuously stirred tank reactor，CSTR)工艺，经70 h连续发酵，乳糖酸产率可达110 g/L·d。Pedruzzi等[67]和Malvessi等[68]也分别利用运动发酵单胞菌进行了乳糖酸生物合成的研究。因此，基于运动发酵单胞菌特有的GFOR-GL酶促反应机制，使得利用该菌联产山梨醇和生物酸成为了可能。

3.3运动发酵单胞菌生产果聚糖

果聚糖是一种果糖聚合物，在食品及医药领域具有重要的用途[69]。实际上，Dawes和Ribbons[70]在1966年就发现在以蔗糖为底物时，运动发酵单胞菌合成乙醇的量减少，其原因是生成了一种新的副产物——果聚糖。之后的研究也进一步证实了运动发酵单胞菌能将蔗糖转化为果聚糖[71～73]。更进一步的研究表明，果聚糖和山梨醇的形成是乙醇产率下降的重要原因[57，58，74]。基于此，Beker等[75]建立了一种利用果糖联产乙醇和果聚糖的发酵工艺，其果聚糖产率可达3.2 g/L·h。分子生物学研究还表明，运动发酵单胞菌具有蔗糖水解所需要的酶SacA、SacB和SacC[76]。基于该研究，Senthilkumar等[77]构建了1株SacC突变的运动发酵单胞菌菌株，提高了果聚糖的产率。Silbir等[78]也通过响应面优化方法，对运动发酵单胞菌产果聚糖的影响因素进行了优化，在最优条件下，果聚糖最大产生速率可达6.556 g/L·h。这些研究为利用运动发酵单胞菌生产果聚糖奠定了基础。

3.4运动发酵单胞菌生产丁二酸

丁二酸，又称琥珀酸，是许多厌氧和兼性厌氧微生物的代谢中间产物。作为一种重要的有机化工原料及中间体，丁二酸广泛用于生物高分子、食品与医药等行业，市场潜在需求量巨大。同时，它作为一种重要的C4平台化合物，被美国能源部认为是未来12种最具前景的生物炼制产品之一[56]。2013年市场研究公司Transparency Market Research发布了关于丁二酸市场的分析报告“Succinic Acid Market-Global Industry Analysis，Size，Share，Growth，Trends and Forecast，2012-2018”，预计到2018年，丁二酸的市场份额可达8.362亿美元。基于这些考虑，利用生物质资源生产丁二酸已成为生物炼制技术的研究热点之一。

目前,用于丁二酸生产的菌株主要包括产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)、产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillumsucciniciproducens)、曼海姆产琥珀酸菌(Mannheimiasucciniciproducens)、脆弱类杆菌(Bacteroidesfragilis)和谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumsp.)[79，80]；同时，重组大肠杆菌[81，82]和酿酒酵母[83，84]等也被用于生物基丁二酸的生产研究。尽管已通过敲除(或失活)丁二酸竞争途径中的酶、增强丁二酸代谢途径及其代谢中的关键酶等代谢工程技术，获得了一些可利用生物质糖发酵生产丁二酸的重组菌株，但由于这些菌株基本采用厌氧发酵方式，且依然伴随大量副产物的形成，给下游的分离工艺增加了成本。

2012年，Lee等[85]构建了一个基于基因组尺度的代谢模型(ZmoMBEL601)，提出了一种利用运动发酵单胞菌高效生产生物基丁二酸的策略，即通过敲除该菌ED代谢途径的关键酶基因：丙酮酸脱羧酶基因pdc、乙醇脱氢酶基因adhB和乳酸脱氢酶基因ldhA。上述这些是基于代谢模拟得到的策略，实际上，Seo等[86]通过基因敲除，已得到一株pdc和ldhA基因的双基因敲除突变株(△pdc△ldhA)，丁二酸产率可达1.46 mol/mol 葡萄糖，可达其理论产率的95%，显示了较大的丁二酸生产潜力。基于这些研究，本实验室也提出了一种利用运动发酵单胞菌生产丁二酸的的策略[14]。Widiastuti等[87]也通过基因组尺度的代谢网络模拟(izm363)，证实了pdc和adh基因在乙醇发酵中的重要功能。Pentjuss等[88]则通过化学计量学系统分析了运动发酵单胞菌在不同培养基条件下的代谢网络。这些研究为深入理解运动发酵单胞菌特殊的生理生化特征及通过代谢调控手段生产目的生物基化学品提供了理论基础。

3.5运动发酵单胞菌生产异丁醇

近年来，异丁醇(isobutanol)因其作为生物燃料的优点，逐渐引起了研究者的兴趣[89，90]。目前，重组大肠杆菌[90～92]、酿酒酵母[93～95]、谷氨酸棒状杆菌[94，96～98]、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)[99]以及真菌-细菌混合菌系(fungal-bacterial consortia)等[100]已被用于生物基异丁醇的研究。同样地，运动发酵单胞菌也作为一种新的模式平台微生物被应用于异丁醇的研究。研究者已通过代谢途径工程将来自乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的2-酮异戊酸脱羧酶基因kivd和乙醇脱羟酶基因adhA转入运动发酵单胞菌中，得到了一株可产生异丁醇的重组菌株[101]。为大幅度提高该重组菌株的异丁醇产量，本实验室提出敲除该菌ED代谢途径的关键酶基因或者通过导入丙氨酸生物合成代谢途径的关键酶基因的策略，如，L-丙氨酸脱氢酶基因alaD[14]。这些研究为利用运动发酵单胞菌生产新型生物液体燃料奠定了基础。

4 展望

通过微生物发酵生产目标产物，错综复杂、多分支的代谢途径是细胞高效生产目标产物的负担，这些途径额外消耗细胞代谢的能量，和产物竞争各种代谢物前体和辅助因子。与大肠杆菌和酿酒酵母等模式生物相比，运动发酵单胞菌具有基因组更小、代谢途径单一和代谢副产物少等优点，显示出了将纤维素生物质转化为乙醇及其他生物基平台化合物的潜力，可成为一种新的平台能源微生物[14]。

尽管目前已完成了该菌的全基因组序列测定，并在转录组学和蛋白质组学层面开展了相关的研究，但总体而言，运动发酵单胞菌在分子生物学层面的研究水平还低于模式生物，并且目前尚未有该菌在生物能源及生物基平台化合物商业化生产中应用的报道。

就纤维素生物质生产大宗生物能源物质及生物基平台化合物而言，其主要制约瓶颈是生产成本问题。而缺乏高效和高胁迫适应能力的发酵菌株是其关键制约因素。理想的菌种应该具备以下生理特性：优化的合成代谢途径；生长速度快；营养需求单一；能高效利用多种底物(尤其是纤维素水解液中的五碳糖和六碳糖等)；对纤维素水解液中的有毒物质(如呋喃甲醛、乙酸等)和目标产物的有耐受能力(有机醇、有机酸等)，对低pH和高温等具有很好的耐受性。但由于这些生理特性的复杂性，难以通过传统的基因工程技术获得相应的表型。因此，未来的研究不仅需要利用现代生物组学技术结合系统生物学研究，阐明复杂表型的分子机制；更需要结合系统生物学和合成生物学技术构建和选育具有优良特性的工程菌株，为纤维素生物质的高效与高值转化奠定基础。目前，一些新的代谢工程技术，如基因组重组、全局转录调控工程技术、适应性进化和最小基因组等技术正逐渐应用于运动发酵单胞菌的改造，为通过该菌商业化生产生物能源及生物基平台化合物提供了新的选择。

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