任其龙， 董新艳， 鲍宗必

(1.浙江大学化学工程与生物工程学系生物质化工教育部重点实验室，浙江杭州310027;2.浙江大学宁波理工学院生物与化学工程分院，浙江宁波315100)

1 循环高效液相色谱技术分离纯化复杂生物源的复合糖

当前，糖生物学领域亟须建立糖标准品库，尽管许多低聚糖已能通过化学合成方法获得，但一些具有重要生理活性的复合糖仍难以合成制备。为解决这一问题，美国印第安纳大学伯明顿分校的Novotny等［1］采用循环高效液相色谱技术从多种天然产物中分离纯化复合糖。循环高效液相色谱由2根色谱短柱和1个十通阀组成，十通阀将待分离组分交替循环输入2根色谱柱进行循环分离，通过连续的循环操作方式实现模拟长柱的色谱分离效果，获得了比传统长色谱柱更高的分离效率。在此之前该方法尚未用于复杂生物活性物质的分离。他们应用此方法通过亲水性色谱柱Amide-80有效分离了海藻低聚糖混合物以及糖蛋白中N-聚糖混合物，并得到纯度＞98%的低聚糖及聚糖同分异构体，如棉子糖和松三糖、3种高甘露糖型聚糖异构体。

2 液相色谱-串联质谱多反应监测法定量分析低聚糖

因缺少标样，不同构型的低聚糖常难以做定量分析。虽然三重四极杆串联质谱多反应监测技术(multiple reaction monitoring，MRM)常用于定量分析复杂混合物中低含量物质，但四极杆质谱的质量检测范围有限，因此MRM很少用于定量分析复杂易变的大分子低聚糖(Mr=5000 Da)等生物分子。美国加州大学的Lebrilla等［2］报道了一种应用液相色谱-串联质谱MRM法定量分析低聚糖的方法。通过对离子源源内条件的优化来提高低聚糖二级质谱母离子的丰度，同时通过对母离子的源内碰撞诱导解离技术研究选择最佳的特征碎片离子对，以得到最佳灵敏度。实验时需选择至少两个离子对用于定量和定性分析，这些离子对对应单电荷的单糖、双糖和三糖离子。该方法的检出限在fmol水平，定量范围跨越5个数量级。仅采用7种低聚糖标样即可用于测定人乳中所有种类的低聚糖，根据响应因子来计算不同结构低聚糖的绝对量和总低聚糖量。

3 在线加氢反应结合二维气相色谱分离脂肪酸甲酯

动植物油脂中的脂肪酸包括饱和、单不饱和及多不饱和脂肪酸，且相同不饱和度的不饱和脂肪酸又有多种同分异构体，成分非常复杂。脂肪酸的单体分离分析具有很大的难度。美国马里兰大学帕克分校的Delmonte等［3］报道了一种二维气相色谱分离脂肪酸甲酯的新方法。他们采用两个长短不同的强极性离子液体毛细管柱SLB-IL111分离脂肪酸甲酯，该色谱柱对具有不同双键数及不同双键位置、构型的脂肪酸甲酯具有较高的分离选择性。此外，将涂覆钯的毛细管置于上述二维色谱之间，以氢气为载气，不饱和脂肪酸在毛细管内经加氢还原生成饱和脂肪酸，还原产物再进入第二维色谱柱进行分离。该方法与常规的二维气相色谱不同，并不是通过改变两柱温度和极性来实现分离，而是在二维色谱间引入化学反应来改变待分析物质的分子结构，从而增强脂肪酸甲酯的分离效果。因此选择两个相同的色谱柱便可对复杂混合样品(如脂肪酸甲酯混合标准品、鲱鱼油中脂肪酸甲酯等)进行色谱分离。

4 不饱和脂肪酸碳碳双键位置的确定

不饱和脂肪酸具有多种双键位置异构体和构型异构体，且不饱和脂肪酸的生物活性及物理化学性质主要取决于其碳碳双键的位置及数目，因此对不同双键位置异构及构型异构体结构的准确鉴定具有重要的意义。质谱法因高灵敏性和选择性且能提供详细的结构信息而成为不饱和脂肪酸结构鉴定的最有效方法之一。然而，由于低能碰撞诱导解离过程产生的碎片离子通常不能明确双键位置，因此仅靠传统的串联质谱法难以有效确定脂肪酸的双键位置。有效的解决方法是在质谱分析前，通过化学衍生化方法对碳碳双键进行标记，并通过衍生物的质谱图来鉴定双键位置。以下是两个实例。

(1)银离子色谱/在线臭氧氧化反应/质谱联用鉴定共轭亚油酸异构体 加拿大阿尔伯塔大学的Curtis课题组［4］采用一种新颖的银离子色谱/在线臭氧氧化反应/质谱(Ag+-LC/O3-MS)方法鉴定共轭亚油酸异构体。从银离子色谱柱流出的含共轭亚油酸异构体的流动相进入一个富含臭氧的渗透性微孔反应管，其中的臭氧由管壁外渗入管内，将共轭亚油酸中的碳碳双键氧化断裂生成醛。该臭氧氧化产物直接进入大气压光电离源(APPI)进行质谱分析，通过分析醛及相应丢失的甲醇碎片离子可直接确定双键位置。这种在线臭氧反应器可以直接连接HPLC和MS，对分析复杂脂类混合物提供多维信息。采用该方法不仅能通过质谱图确定共轭亚油酸位置异构体，而且还能通过银离子色谱的洗脱顺序确定共轭亚油酸双键构型异构体。他们用这一方法快速直接地确定了复杂脂肪酸混合物如牛奶脂肪、乳酸菌脂肪中的共轭亚油酸异构体。

(2)利用Paternò-Büchi反应耦合质谱鉴定脂肪酸中双键位置 美国普渡大学的Xia教授等［5］报道了一种通过Paternò-Büchi反应结合串联质谱鉴定不饱和脂肪酸碳碳双键位置的新方法。Paternò-Büchi反应是在紫外激发下，将醛或酮的羰基活化生成自由基，再进一步和脂肪酸碳碳双键反应生成氧杂环丁烷。采用三重四极杆线性离子阱质谱仪检测，反应产物经碰撞活化促进逆向Paternò-Büchi反应，生成新的烯和酮，并产生能反映母体分子的碎片离子，从而确定不饱和脂肪酸的碳碳双键位置。他们应用此方法有效鉴定了油酸、亚油酸、卵磷脂混合物、酿酒酵母中脂肪酸中的双键位置。该方法可灵敏分析fmol量级的脂肪酸及复杂脂类混合物。此方法无需对质谱仪进行调整，常规实验设备即可满足在线Paternò-Büchi反应。不足的是，副反应的存在使得复杂脂类混合物的质谱图非常复杂，降低了检测的灵敏度，增加了结构分析的难度。将在线Paternò-Büchi反应和色谱分离相结合或许可解决这一问题。

［1］ Alley W R，Mann B F，Hruska V，et al.Anal Chem，2013，85:10408

［2］ Hong Q，Ruhaak L R，Totten S M，et al.Anal Chem，2014，86:2640

［3］ Delmonte P，Fardin-Kia A R，Rader J I.Anal Chem，2013，85:1517

［4］ Sun C，Black B A，Zhao Y Y，et al.Anal Chem，2013，85:7345

［5］ Ma X，Xia Y.Angew Chem Int Ed，2014，53:2592