陆必科

（百色市动物疫病预防控制中心，广西 百色 533000）

食品安全是一个重要的公共卫生问题。不仅给畜牧业生产造成直接损失，同时也影响个人、家庭、社会、商业及整个国家经济利益。因此，必须从饲养到餐桌全过程采取综合措施，切实做好畜产品质量安全监测。胶体金免疫层析法以其体积小、携带方便、不需辅助仪器设备、操作简便、可现场检测、检测结果用时短、适合对大批量样品进行现场初筛等诸多优点，可以为现场执法带来科学的依据，在兽药残留检测中倍受青睐，具有巨大的发展潜力和广阔的应用前景。

1 胶体金免疫层析技术的检测原理

1.1 胶体金免疫试纸条的结构

胶体金免疫试纸条以PVC为底板，从下到上依次粘贴样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。样品垫与硝酸纤维素膜胶体金结合垫之间有重叠1～2mm，NC膜与吸水垫重叠1.8～2.0mm。样品垫用来吸收样品溶液；胶体金结合垫上吸附有胶体金标记的抗体；NC膜上分别喷点了抗原-蛋白质藕联物（T线，检测线）和相应的二抗（C线，控制线）。

1.2 胶体金免疫层析法的检测原理

胶体金免疫层析法的检测原理是将特异抗体先固定在硝酸纤维膜的某一区域，当干燥的硝酸纤维素一端滴入样品溶液后，由于毛细血管作用，样品溶液将沿着该膜向前移动，当移动到固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。

2 兽药残留的危害

兽药残留是指用药后蓄积或存留于畜禽机体或产品中的原型药物或其代谢物，包括与兽药有关的杂质残留。兽药残留可分为抗生素类、抗原虫药类、生长促进剂类、驱肠虫药类、灭锥虫药类、镇静剂类、β-受体激动剂类、重金属及生物毒素类。

2.1 对人体产生毒性反应

2.2 导致“三致”作用

现已发现许多兽药具有致癌、致畸、致突变作用。丙硫咪唑等具有致畸作用；雌性激素、砷制剂等已被证明具有致癌作用；喹诺酮类药物的个别品种已在真核细胞内发现有致突变作用；磺胺二甲嘧啶等磺胺类药物在连续给药中能够诱发啮齿动物甲状腺增生，并具有致肿瘤倾向；链霉素具有潜在的致畸作用。

2.3 产生过敏反应

许多抗菌药物如青霉素、磺胺类和四环素类等能使部分人群发生过敏反应甚至休克，并在短时间内出现皮疹、喉头水肿、呼吸困难、血压下降等严重症状。

2.4 产生耐药菌株

随着抗菌药的不断应用，细菌中的耐药菌株也在不断增加。抗菌药物残留于动物性食品中，使得人不可避免地长期与药物接触，会抑制或杀灭体内对抗菌药敏感的微生物族群，剩下的都是对抗菌药有耐药性的微生物群族，导致人体内耐药菌的增加致使平衡破坏。

2.5 引起肠道菌群失调

有抗菌药物残留的动物源食品可对人类胃肠的正常菌群产生不良影响，使一些非致病菌被抑制或死亡，造成体内菌群的平衡失调，从而导致长期的腹泻或引起维生素的缺乏。

2.6 影响畜牧业的健康持续发展，造成环境污染

养殖环节抗生素的滥用，增进了耐药菌株的产生，使得细菌病的控制变得越来越困难，严重制约着畜牧业的健康持续发展。动物用药后，药物以原型或代谢产物的方式进入生态环境，从而造成环境中的药物残留。兽药残留在环境中被动物、植物富集，然后进入食物链，危害人体健康。

3 胶体金免疫层析技术在兽药残留方面的应用

随着规模化、集约化畜牧业的发展，兽药的应用品种和数量不断增加，动物食品及其产品中兽药残留成为危害人类健康和影响畜产品质量安全的重要因素[1]。虽然兽药残留检测方法很多，但多数皆因仪器昂贵、操作繁琐、费时而受到基层应用的限制。而胶体金免疫层析法具有灵敏、特异、方便、快捷、不需辅助仪器和试剂等特点成为目前最主要的快速分析方法之一。以胶体金免疫层析技术为基础的试纸条也在快速检测领域中发挥着极其重要的作用，在兽药残留检测的初筛中得到广泛研究与应用。利用胶体金免疫层析法快速检测试纸条来初测畜产品中的违禁药物及重金属离子含量，可以节省时间，加快检测进度，提高现场抽查和快速检测的效率，其灵敏度、稳定性、特异性等均能达到检测要求。

3.1 在氯霉素残留检测中的应用

氯霉素是一种广谱抗生素，具有良好的抗菌药理特性，被广泛应用于各类家禽、家畜、水生动物及蜜蜂的各种传染病防治。但随着科学的发展，氯霉素被证明对机体有严重的毒副作用[2]。氯霉素在动物性食品中的残留对人类的健康构成了潜在的危害，其在动物肉、奶、蛋等食品中的残留严重威胁人体健康[3]。随着人们对食品安全的日益重视和进出口贸易的高速增长，迫切需要一种能快速、稳定地检测氯霉素残留的方法。王玉金等将氯霉素单克隆抗体-胶体金复合物包被在胶体金结合垫上，并将人工合成的氯霉素抗原包被在硝酸-醋酸纤维素薄膜表面作为检测线（T线），其与待测样品中氯霉素竞争结合胶体金标记的氯霉素单克隆抗体，并能以颜色直观显示检测结果[4]。该法与ELISA方法试剂盒对比检测了60份牛奶标本，两法符合率100%。李余动等采用竞争法研制了金标试纸条，将胶体金标记氯霉素单抗，并将人工合成的氯霉素包被于检测线，其与待测样品中氯霉素竞争结合金标氯霉素单抗，检测虾肉等组织样品时，最低检测线可达到1 ng·mL-1[5]。该法特异性强，灵敏度高，简便快捷，无需特殊仪器设备。

评估量表是一种预测、评估、筛选压疮高危人群的工具，根据我院收治患者的实际需求，改良压疮风险评估量表具有实用、直观等特点，且该评估量表内容清晰、操作简单，可降低护理人员的工作强度，从而提高评估正确率[5]。本研究结果显示，对照组患者压疮危险因素评估正确率明显低于观察组，差异有统计学意义（P＜0.05），对照组患者的压疮发生率明显高于观察组，差异有统计学意义（P＜0.05），证实改良压疮风险评估量表效果显著，有利于压疮规范化管理，达到患者安全管理目标。

3.2 在链霉素残留检测中的应用

链霉素是一种广谱抗生素，曾作为饲料添加剂和治疗动物疾病在畜牧业生产中广泛应用，在降低动物发病率与死亡率、促生长、提高饲料利用率和改善产品品质等方面的效果优良，尤其是在防治结核杆菌感染等方面作用显著，因此链霉素已成为畜牧业发展中不可缺少的物质基础[6-7]。但链霉素长期用于治疗动物疫病和作为饲料添加剂会导致动物体内药物滞留和蓄积，并对人类和环境健康产生一系列的危害[8]。朱继帅采用单克隆抗体和胶体金免疫层析技术，合成并制备了链霉素人工抗原、抗链霉素单克隆抗体和胶体金，采用竞争法建立了链霉素胶体金免疫层析试纸条，试验表明，该试纸条检测链霉素的灵敏度达200 ng·mL-1，对新霉素、庆大霉素、丁脆卡那、恩诺沙星等交叉反应率均＜0.1%，能基本满足链霉素残留检测需要[9]。

3.3 在磺胺类药物残留检测中的应用

磺胺类药物作为应用广泛的抗菌素，由于其具有较强的抗细菌作用，常被用作饲料添加剂广泛添加到畜牧饲料中，但会引起人体过敏反应，并具有一定程度的致癌性。因此，磺胺类药物的残留问题倍受关注。根据农业部的部署，从2005年起，将把畜产品中磺胺类药物的残留情况作为继瘦肉精之后的又一个重点予以监控。韩静等采用柠檬酸三钠还原法制备粒径为20 nm的胶体金，将对磺胺类药物具有广谱特异性的多克隆抗体-胶体金复合物喷涂在玻璃纤维上，并将人工合成的包被抗原（SAS-OVA）、羊抗兔二抗固定在硝酸纤维素薄膜上作为检测线和质控线，待测样品中的磺胺类药物与包被抗原竞争结合胶体金标记的抗磺胺类药物的多克隆抗体，视觉检测线为0.01mg·kg-1，建立了一种用于快速检测动物源性食品中5种磺胺类药物[10]。操作快速、简单，结果稳定可靠，可作为磺胺类药物多残留现场监控的有效筛检手段。

3.4 在四环素类药物残留检测中的应用

四环素类药物为广谱抑菌剂，高浓度时具有杀菌作用。由于四环素类药物的广泛应用，临床常见病原菌包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌对四环素大都有耐药性。此外，四环素的滥用还引起该类药物在动物的肌肉、奶、肝脏中残留，严重危害人类健康。檀尊社等采用免疫竞争法，将抗四环素单克隆抗体2胶体金复合物包被在胶体金结合垫上，并将人工合成的四环素抗原包被在硝酸纤维素薄膜表面作为检测线（T线），其残留药物与待测样品中四环素竞争结合胶体金标记的四环素单克隆抗体，最终能以颜色直观显示检测结果，建立了快速检测水产品中四环素类药物残留含量的胶体金免疫层析法检测试纸条[11]。检测水产品试样时，试剂灵敏度可达100 ng·mL-1，与金霉素、土霉素、强力霉素等四环素族抗生素有很强的交叉反应，故可同时检四环素族中几种抗生素，而与沙丁胺醇、莱克多巴胺等其他兽药无交叉反应。试验证明，该试剂具有较高的灵敏度及特异性，操作便捷，稳定可靠，可作为四环素残留现场监控的有效筛检手段。

3.5 在瘦肉精检测中的应用

盐酸克伦特罗，俗称“瘦肉精”，是一种 β2-肾上腺素能激动剂，在动物体内能增强脂解和减慢蛋白质分解代谢，具有调节营养物质的流向和重新分配的作用，在畜牧生产中大剂量使用可显著提高饲料转化率和瘦肉率。近年来，动物性产品中盐酸克伦特罗残留所造成的破坏已经引起高度重视。由于国家加强对盐酸克伦特罗的监控，有效打击了生猪养殖中非法使用克伦特罗的行为。但由于利益的趋使，克伦特罗的替代品莱克多巴胺、沙丁胺醇等又悄然兴起。张慧嫦等采用免疫学竞争法，将抗盐酸克仑特罗单克隆抗体-胶体金复合物包被在胶体金结合垫上，并将人工合成的盐酸克伦特罗抗原包被在硝酸纤维素薄膜表面作为检测线（T线），其与待测样品中盐酸克伦特罗竞争结合胶体金标记的盐酸克伦特罗单克隆抗体，并能以颜色直观显示检测结果，检测猪肉等组织时，灵敏度最低值达0.5 ng·mL-1，只须3～5min，与沙丁胺醇、莱克多巴胺的交叉反应为0.86%[12]。高以明等采用混合酸酐法制备莱克多巴胺-OVA偶联抗原，胶体金标记莱克多巴胺单克隆抗体，建立了检测莱克多巴胺的胶体金免疫层析试验，最低检测限10 ng·mL-1，与克伦特罗、沙丁胺醇无交叉反应[13]。吴巧丽等采用胶体金免疫竞争法，将兔抗沙丁胺醇多克隆抗体-胶体金标记物包被在胶体金聚酯结合垫上，并将沙丁胺醇-BSA抗原包被在硝酸纤维素薄膜上作为检测线，与待测样品中的沙丁胺醇竞争结合胶体金标记的兔抗沙丁胺醇多克隆抗体，从而判断试样中是否有沙丁胺醇存在，可检测猪肉等组织和饲料试样中沙丁胺醇，最低检测限为2 ng·mL-1与盐酸克伦特罗的交叉反应率为2.67%，且试验在3min内完成，肉眼可判读结果[14]。 以 上3种方法灵敏度高、特异性好，可各用于现场3种瘦肉精的快速检测和筛查。

3.6 在呋喃类药物残留检测中的应用

呋喃类药物与蛋白质结合的产物能在体内稳定残留，具有潜在的致癌和诱导突变的作用。我国农业部规定动物性食品中不得检出呋喃唑酮。徐霞玲等应用免疫胶体金层析竞争原理，研制了检测猪肉中呋喃妥因代谢物1氨基乙内酰脲（AHD）的免疫试剂条，该试剂条对AHD的最低检测限为2.33 μg·L-1，除与呋喃妥因有弱交叉外，与其他同类药物均无交叉反应，灵敏度高，简便快捷，可作为呋喃妥因残留批量检测的筛选方法[15]。赵正苗等应用胶体金免疫层析法检测鸡肉、猪肉中残留的呋喃西林代谢物，首次将胶体金标记的抗体直接冻干在微孔试剂中，使金标抗体与待检样品液充分接触，增加整个体系的反应灵敏度，试纸条检测限为1.0 μg·L-1，假阳性率＜5%，假阴性率为0，特异性高，与其他药物无交叉反应[16]。何方洋等建立了一种基于免疫胶体金技术的硝基呋喃类药物的快速检测方法，该方法对饲料中呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因的最低检测限分别达5、3、2、2μg·L-1，对饲料样本检测的假阳性率为2%，假阴性率为0，可以应用于饲料样本中硝基呋喃类药物的快速检测和现场筛查[17]。

3.7 初测畜产品中的重金属离子含量

目前，国内外已经建立了针对有机污染物的免疫胶体金快速检测方法，并将该方法用于重金属离子的分析检测，迄今为止，免疫胶体金技术已成功用于铅、镉、汞、铀等的检测。

3.8 在毒素检测方面

赖卫华等研制的胶体金试纸条用于检测赭曲霉毒素A，检测限为10 ng·mL-1[18]。用于饲料中赭曲霉毒素A的快速检测和筛查。定性、特异性等均能达到检测要求。

4 主要问题和发展方向

4.1 主要问题

胶体金免疫层析法具有简单快速、敏感特异、稳定性好、无需辅助仪器设备、结果判读容易等诸多优点。但由于兽药残留具有待测物质浓度低，样品基质复杂，干扰物质多，兽药残留代谢产物多样或不明，动物种类多且对药物代谢存在差异等特点，使胶体金免疫层析技术在兽药残留检测过程中存在着检测灵敏度亟待提高，出现假阳性，检测药物种类少，无法实现数据处理和存储等问题，同时，现有的检测产品质量参差不齐，对检测产品生产厂家没有严格规范的管理体系。

4.2 发展方向

进一步提高免疫胶体金层析技术的灵敏度、实现多元检测、实现定量或半定量检测是金标免疫快速试纸条发展的主要方向。

4.2.1 提高快速检测试纸条的灵敏度和特异性

胶体金免疫快速检测试纸条敏感度许多都可达到1 ng·mL-1或更低水平，但有些检测方法不能达到很高的灵敏度，通过生物素亲和素系统和免疫金银染色法进行银加强试验或对膜进行化学修饰都能在一定程度上提高试验的敏感度和特异性。

4.2.2 实现定量或半定量检测

胶体金免疫快速试验多数产品为定性产品，现在出现了一些定量或半定量产品，有的是根据和对照线（卡）颜色的色差来确定待测物的浓度，有的是通过多条平行检测带最后出现的条数来确定其含量的试验，或使用反射光密度计测定光密度强度而得出的数字结果。

4.2.3 实现快速检测试纸条现场检测的多元化功能

目前，我国畜牧业中使用的抗生素各类兽药种类繁多，这不仅增加了动物源性食品中兽药残留的几率，也给广大人民群众生命安全带来了潜在的危害，同时也加大了执法机关检测的任务和难度。而现有的胶体金试纸条大多只能检测同一样品中的一种药物，如果能开发出可采用在同一膜上进行多种药物测定的快速检测试纸条，将对检测某些具有联检意义的物质具有很大的应用价值，并可以大幅提高工作效率。目前已经研发出许多多元检测系统，可同时检测多种项目。例如牛奶中多种抗生素残留的同步检测产品，β-内酰胺类和四环素类抗生素快速检测试纸条、β-内酰胺类和三聚氰胺快速检测试纸条、磺胺类和氟喹诺酮类药物快速检测试纸条等，大幅节省了检测的时间和成本。未来要将这种技术进一步改进，实现针对更多的样本基质和检测药物，达到“一卡多用”的效果。

4.2.4 实现现场操作与读卡仪等仪器现场配合联用，解决现场数据处理和存储

由于成本低、检测时间短、操作简便，胶体金试纸条在国内外都是一个比较成熟的检测技术。但在应用过程中，该技术仍然存在一些局限性，例如试验结果无法实现自动化存储，对结果的主观判断容易导致高假阳性、假阴性几率，结果无法准确定量，人工操作导致试验的生产能力有限等。这就为该项技术的发展提出了更高的要求，试纸条读卡仪等仪器就是在这样的背景下产生的。试纸条读卡仪就是能采用射频信号识别颜色变化的一种识别仪。通过射频信号自动识别目标对象并获取相关数据，识别工作无需人工干预，操作快捷方便。同时，操作人员可以建立针对现场的快速检测体系，对食品安全风险进行有效把控，建立可记录、存储、传输、分析汇总、追溯的食品安全检测全程数据分析系统。这样，从政府监管机构层面来讲，为体系的建立提供了可溯源的监控依据，从而达到对所有与食品生产加工有关过程的全程检验监督，确保科学有效的执法；而从食品生产加工企业的层面来讲，系统的建立提供了可靠的食品安全参考依据，确保了产品的质量安全，保证了消费者的健康，也便于执法机构的有效监管。

5 小 结

随着科学技术的发展，食品安全的快速检测方法在兽药残留及食品卫生检验方面起着越来越重要的作用。从长远发展来看，胶体金试纸卡作为一种在仪器确证试验之前的快速筛查手段，技术操作简单、快速、特异性强、价格低，对建立更敏感快捷的食品安全检测方法起到了积极促进作用，为畜禽产品中兽药残留结果的确证打下了坚实地基础。

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