黄 聪，李再园，王福莲*，张桂芬，李传仁，李咏军

(1.长江大学农学院，湖北 荆州 434025;2.中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193)

昆虫属于变温动物，温度是影响其种群动态的一种最基本的因素，在某些地区，寒冷冬季的持续低温对昆虫种群的延续构成了严重威胁，因此昆虫往往通过调节自身的过冷却 (supercooling)状态以增强其抗寒性，使其种群得以繁衍和延续(Maureen and Richard，1990;崔双双和贺一原，2011)。昆虫过冷却是指温度低于昆虫体液结冰点时，其体液仍能保持液体状态的现象 (李冰祥等，1998);耐寒性是指昆虫维持虫体的过冷却状态，使之免受冻害的能力 (Lee，1989)。在昆虫耐寒性研究中，过冷却点 (supercooling point，SCP)常作为一项重要指标来界定昆虫的耐寒性强弱 (侯柏华和张润杰，2007)。通过过冷却点的测定，有助于了解某种昆虫的抗寒能力，更好地掌握其生殖、扩散、发生分布规律以及下一季节的种群发生状态等 (McDonald et al.，1999;Sage et al.，1999)。McDonald等 (2000)的研究指出，明确昆虫的耐寒性及其越冬生物学特性，对于掌握其在某一地区的分布现状、种群扩张趋势，以及实时预测预报和根治等均具有重要作用。

柑桔大实蝇为一化性昆虫，成虫产卵于柑桔幼果内，卵孵化为幼虫后，取食桔瓣，于柑桔内完成发育;10月中下旬幼虫脱果入土化蛹，11月上中旬大部分幼虫已入土化蛹，进入越冬状态;翌年3月下旬至4月上旬滞育蛹解除滞育开始发育，4月下旬至5月上旬成虫开始羽化 (吴志清，1958;罗禄怡和陈长风，1987;汪兴鉴和罗禄怡，1995;王小蕾和张润杰，2009)。因此，幼虫和蛹对低温的耐受能力以及当地冬季的温度状况共同决定了柑桔大实蝇的越冬虫源基数，进而影响来年柑桔大实蝇的发生动态和种群发生数量。本研究拟通过测定柑桔大实蝇老熟幼虫和滞育蛹以及已解除滞育进入发育状态的蛹的过冷却点和结冰点，以期揭示柑桔大实蝇的耐寒性及其对低温的适应能力，为准确预测其在我国的适生区、扩散区域及虫源地越冬虫口基数，为有效预测和制定柑桔大实蝇综合防控策略提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

柑桔大实蝇的老熟幼虫于10月下旬采自湖北省松滋市斯家场镇旗林村。老熟幼虫化蛹后已进入滞育状态的5日龄蛹作为滞育蛹 (范京安等，1994);翌年4月上旬当越冬蛹发育为一级时，作为已解除滞育进入发育状态的蛹。

1.2 过冷却点的测定

过冷却点的测定参考秦玉川和杨建才 (2000)以及吕龙石等 (2010)的方法，测定仪器为数字万用电表 (DT 9205A，广州恒惟电子科技有限公司)以及热敏电阻 (NTC－MFH103，10KΩ，精度1%，25℃ B值3950;杭州电子市场恒坚电子商行)。测定前用洁净滤纸吸干老熟幼虫或蛹体表面的水分，用自制的昆虫夹 (由晾衣竹片夹和温敏电阻组成，竹片夹由两瓣竹片和一根弹簧组成，每瓣竹片长6.2 cm，宽1.1 cm，厚0.6 cm，竹片内侧中间位置均匀分布有3个直径为0.4 cm的凹槽，两端凹槽距竹片端部均为2 cm，两片竹片并拢时上下凹槽组成3个直径为0.4 cm、高1.1 cm的圆柱型空间，其中弹簧固定在竹片夹一端的凹槽内，温敏电阻固定于另一端的凹槽处)迅速夹住供试昆虫 (使虫体腹面紧贴热敏电阻)，用脱脂棉包好昆虫夹放入缓温管 (50 mL指形管，长11 cm，直径3 cm)内，于25℃可控低温保存箱内(DW－25W198，青岛海尔特种电器有限公司)进行电阻值变化的观测。NTC－MFH103型玻璃热敏电阻为负温度系数热敏电阻，亦即，随虫体体温的下降，热敏电阻值上升。当电阻值逐渐上升到某一数值R1i时，体液开始形成冰晶而放热使电阻值突然下降，此时R1i所对应的温度值即为过冷却点;当下降到最低点R2i时，体液开始结冰，不再放热，电阻值又会逐渐上升，此时R2i所对应的温度值即为结冰点，观察结束 (秦玉川和杨建才，2000;吕龙石等，2010)。每个虫态过冷却点和结冰点测定30－35头。

1.3 数据分析

NTC－MFH103型玻璃热敏电阻的温度系数B值的计算公式为:B=t1t2ln(rt1/rt2)/(t2－t1)，其中 t1、t2为生产厂家提供的热敏电阻 Ri(kΩ)在rt1和rt2范围时所对应的温度值，为绝对温标ti+273.15;过冷却点和结冰点温度Ti(℃)的计算公式为:Ti=t2B/［B+t2ln(Ri/r2)］ －273.15，Ri为过冷却点或结冰点所对应的电阻值(吕龙石等，2010)。

采用单一样本Kolmogorov－Smirnov法检验分析不同发育状态过冷却点和结冰点的频次分布特征，并以过冷却点或结冰点值为横坐标作相对频率分布图，以单一变量最小显著差法进行方差分析 (SPSS)，比较柑桔大实蝇不同发育状态的过冷却点、体液结冰点及体液结冰点与过冷却点之间差值的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 柑桔大实蝇不同发育状态的过冷却点、结冰点及其差值

柑桔大实蝇的发育状态不同，其过冷却点各异，而且三种发育状态间的过冷却点差异显著(表1)。按过冷却点由高到低依次为老熟幼虫、滞育蛹和滞育解除蛹，分别为 －7.09℃、－8.93℃和－11.15℃;进而其耐寒性的高低依次为滞育解除蛹＞滞育蛹＞老熟幼虫。已解除滞育进入发育状态的蛹的过冷却点变异范围最大，为－15.36～－7.45℃;滞育蛹过冷却点的变异范围最小，为－11.09～－8.03℃。不同虫态体液结冰点之间也存在显著差异 (表1)，滞育解除蛹的结冰点最低为－9.76℃，其次为滞育蛹为 －7.63℃，而老熟幼虫的结冰点最高为－3.43℃。其中，已解除滞育进入发育状态的蛹的过冷却点的变异范围最大，最低值为－13.49℃，最高值为－6.64℃;滞育蛹过冷却点的变异范围最窄，最低值为－9.03℃，最高值为－6.64℃。老熟幼虫结冰点与过冷却点之间的差值最大为3.24℃，显著高于滞育蛹(1.30℃)和滞育解除蛹 (1.39℃)。而且，老熟幼虫结冰点与过冷却点之间差值的变异范围最大，最低值为1.39℃，最高值为6.15℃;滞育解除蛹的变异范围最窄，最低值为0.61℃，最高值为2.45℃ (表1)。

表1 柑桔大实蝇不同发育状态的过冷却点、结冰点及其差值 (℃ ，Mean±SE)Table 1 The supercooling points(SCP)，freezing points(FP)and their differences among different developing status of Bactrocera minax

2.2 柑桔大实蝇不同发育状态过冷却点和结冰点的相对频率分布

图1 柑桔大实蝇不同发育状态过冷却点和结冰点的分布频率Fig.1 Distribution frequency of supercooling point and freezing point at different developing status of Bactrocera minax

测定结果表明，三种发育状态的柑桔大实蝇其过冷却点和结冰点均只有一个高峰，而且经检验其频次分布特征均符合正态分布。其中，老熟幼虫的过冷却点和结冰点较高，分别集中在－3.5～－9.5℃以及－1.5～－5.5℃;滞育蛹次之，分别集中在－7.5～－11.5和－5.5～－9.5℃;而滞育解除蛹的过冷却点和结冰点最低，分别集中在－8.5～ －14.5℃和－6.5～ －12.5℃ (图1A，B)。进而表明，经过冬季低温驯化已进入发育状态的蛹的抗寒性最强，其次为刚刚进入滞育状态的蛹，而老熟幼虫的抗寒性最弱。

3 结论与讨论

昆虫的越冬策略主要有两种类型，一是不耐结冰型 (freezing intolerant)，又称避冻策略，这类昆虫对体液中的冰晶所形成的损伤特别敏感，但它能尽量降低自身的过冷却点，从而避免体液结冰以增强耐寒力，绝大多数昆虫属于这一类型;二是耐受结冰型 (freezing－tolerant)，又称耐冻策略，这类昆虫能够主动地形成冰核，通过提高过冷却点以诱导细胞外液在较高的亚致死温度下结冰，阻止细胞内液的进一步结冰，使胞内亚细胞结构免受伤害，从而避免造成更大的损伤 (Bale，2002;Jason and Richard，2002;Renault et al.，2002;景晓红和康乐，2002;Brent et al.，2003)。本实验结果表明柑桔大实蝇的越冬策略属于避冻策略，老熟幼虫过冷却点为－7.09℃，化蛹后通过降低自身过冷却点至－8.93℃进入滞育状态，从而增强耐寒性;翌年4月份，在外界环境因素的作用下，柑桔大实蝇滞育蛹解除滞育后，其过冷却点再次降低至－11.15℃，说明越冬后进入发育状态的蛹抗寒能力较滞育蛹更强。黄大树等(2007)研究发现，柑桔大实蝇越冬后蛹的抗逆性比越冬前蛹的抗逆性更强，越冬前11月上旬挖蛹预埋，越冬后的死亡率高达84.5%;而越冬后4月上旬挖蛹，以同样的方法预埋，其死亡率仅为34.5%。进而表明，经过自然低温的冷驯化，柑桔大实蝇的抗寒能力增强了，亦即，抵御早春突发低温危害的能力更强了 (Lee et al.，1987;Maureen and Richard，1990)。

近年来，在大量的昆虫抗寒性研究中，过冷却点已经成为评价昆虫耐寒性强弱的一个重要指标，但某些昆虫的大量死亡常出现在过冷却点以上的亚致死温度 (Maureen and Richard，1990)，因此过冷却点并非评价昆虫耐寒性的唯一指标，亦不能作为昆虫存活的下限温度;除过冷却点以外，界定昆虫耐寒性的指标还有昆虫的体液结冰点和低温存活能力等 (Bale，1996;Nedved et al.，1998;Chen and Kang，2002;Renault et al.，2002)。本研究结果表明，柑桔大实蝇滞育蛹和滞育解除蛹的过冷却点均较老熟幼虫的低，而范京安等(1994)的研究指出，柑桔大实蝇蛹的抗寒能力较老熟幼虫弱，老熟幼虫在0℃条件下可成活20 d以上，少数可达29 d;在3℃时，93%以上的老熟幼虫能完成化蛹，死亡率极低;而蛹在3℃处理30 d后全部死亡，6℃处理30 d，只有26.6%的蛹能羽化为成虫，这可能与蛹解除滞育后暴露在低温环境中有关 (范京安等，1994)。Renault等 (2002)的研究显示，即使在其过冷却点以上的低温环境中，暴露较长的时间也会导致昆虫的死亡，这可能与幼虫和蛹经过低温驯化后获得的抗寒能力的大小不同有关。本文结果中老熟幼虫的结冰点和过冷却点之间的差值最大，这种差值的大小是否与其在低温驯化过程中获得的抗寒能力的大小有关?尚有待进一步研究。

References)

Bale JS.Insect cold hardiness:a matter of life and death［J］ .European Journal of Entomology，1996，93:369－382.

Bale JS.Insects and low temperatures:from molecular biology to distributions and abundance［J］.Philosophical Transactions of the Royal Society B:Biological Sciences，2002，357(1423):848－862.

Brent JS，Bediako AA，Steven LC.Climatic variability and the evolution of insect freeze tolerance ［J］.Biological Reviews，2003，78:181－195.

Chen B，Kang L.Cold hardness and supercooling capacity in the pea leafminer Liriomyza huidobrensis ［J］.CryoLetters，2002，23:173－182.

Cui SS，He YY.Insect cold hardiness and the influencing factors［J］.Life Science Research，2011，15(3):273－276.［崔双双，贺一原.昆虫的耐寒性及其影响因素 ［J］.生命科学研究，2011，15(3):273 －276］

Fan JA，Zhao XQ，Zhu J.A study on the cold－resistance and diapause in Tetradacus citri Chen［J］.Journal of Southwest Agricultural University，1994，16(6):532－534.［范京安，赵学谦，朱军.柑桔大实蝇 (Tetradacus citri Chen)耐寒及滞育性研究［J］.西南农业大学学报，1994，16(6):532－534］

Hou BH，Zhang RJ.Supercooling capacity of the Oriental fruit fly，Bactrocera dorsalis(Hendel)(Diptera:Tephritidae)［J］.Acta Entomologica Sinica，2007，50(6):638－643.［侯柏华，张润杰，2007.桔小实蝇不同发育阶段过冷却点的测定［J］.昆虫学报，50(6):638－643］

Huang DS，Xiao GZ，Yang YA，et al.The occurrence，damage，prevention and control technology of Bactrocera(Tetradacus)minax(Enderlein)，in Taoyuan County ［J］.Plant Quarantine，2007，21(4):233－235.［黄大树，肖桂章，杨佑安，等.桃源县柑橘大实蝇的发生危害与防控技术［J］.植物检疫，2007，21(4):233 －235］

Jing XH，Kang L.Research progress in insect cold hardiness［J］.Acta Ecologica Sinica，2002，22(12):2202－2207.［景晓红，康乐.昆虫耐寒性研究［J］.生态学报，2002，22(12):2202－2207］

Jason TI，Richard EL.Energy and water conservation in frozen vs.supercooled larvae of the Goldenrod Gall Fly，Eurosta solidaginis(Fitch)(Diptera:Tephritidae)［J］.Journal of Experimental Zoology，2002，292:345－350.

Lee RE，1989.Insect cold hardiness:to freeze or not to freeze［J］.Bioscience，39(2):308 －313.

Lee RE，Chen CP，Denlinger DL.A rapid cold－hardening process in insects［J］.Science，1987，238:1415 －1417.

Li BX，Chen YL，Cai HL.The supercooling and cold hardiness of insect［J］.Entomological Knowledge，1998，35(6):361 －364.［李冰祥，陈永林，蔡惠罗.过冷却和昆虫的耐寒性［J］.昆虫知识，1998，35(6):361－364］

Lü LS，Cong ML，Meng YL.A simple device for testing insect supercooling point［J］.Entomological Knowledge，2010，47(6):1257－1260.［吕龙石，丛明亮，孟艳玲.一种昆虫过冷却点的简易测定装置 ［J］.昆虫知识，2010，47(6):1257－1260］

Luo LY，Chen CF.The biological property of Bactrocera minax(Enderlein)pupae［J］.Chinese Citris，1987，(4):9－10.［罗禄怡，陈长风.柑桔大实蝇蛹的生物学特性［J］.中国柑桔，1987，(4):9 －10］

MacDonald JR，Bale JS，Walters KFA.Temperature，development and establishment potential of Thrips palmi(Thysanoptera:Thripidae)［J］.European Journal of Entomology，1999，96:169－173.

MacDonald JR，Head J，Bale JS，et al.Cold tolerance，overwintering and establishment potential of Thrips palmi［J］.Physiological Entomology，2000，25:159－166.

Maureen CC，Richard EL.A rapid cold－hardening response protecting against cold shock injury in Drosophila melanogaster［J］.Journal of Experimental Biology，1990，148:245 －254.

Nedved O，Lavy D，Verhoef HA.Modeling the time－temperature relationship in cold injury and effectofhigh temperature interruptions on survival in a chill－ sensitive collembolan ［J］.Functional Ecology，1998，12:816－824.

Qin YC，Yang JC.A new simple method to test insect super－cooling point［J］.Entomological Knowledge，2000，47(4):236 －238.［秦玉川，杨建才.一种便携式测定昆虫过冷却点的方法［J］.昆虫知识，2000，47(4):236－238］

Renault D，Salin C，Vannier G，et al.Survival at low temperatures in insects:What is the ecological significance of the supercooling point?［J］CryoLetters，2002，23:217 －228.

Sage RB，Fell D，Tucker K，et al.Post hibernation dispersal of three leaf－eating beetles(Coleoptera:Chrysomelidae)colonizing cultivated willowsand poplars［J］. Agricultureand Forest Entomology，1999，1:61－70.

Wang XJ，Luo LY.Research progress in Chinese citrus fruit fly ［J］.Entomology Knowledge，1995，32(5):310－311.［汪兴鉴，罗禄怡.桔大实蝇的研究进展［J］.昆虫知识，1995，32(5):310 －311］

Wang XL，Zhang RJ.Review on biology，ecology and control of Bactrocera(Tetradacus)minaxEnderlein［J］. Journalof Environmental Entomology，2009，31(1):73－79.［王小蕾，张润杰.桔大实蝇生物学、生态学及其防治研究概述［J］.环境昆虫学报，2009，31(1):73－79］

Wu ZQ.The preliminary study on the living behavior of Bactrocera minax(Enderlein)［J］.Entomology Knowledge，1958，4(5):216 －217.［吴志清.桔大实蝇的生活习性观察初报 ［J］.昆虫知识，1958，4(5):216－217］