裴丽玲综述，李建生，任维华审校

·综述·

miRNAs与肝细胞癌发生研究进展*

裴丽玲综述，李建生，任维华审校

MicroRNAs（miRNAs）是一类长度为21～25个核苷酸的非编码小分子RNA,参与基因转录后调控。研究发现，miRNAs的异常表达与疾病，尤其是恶性肿瘤的发生发展密切相关。miRNAs在不同癌症中水平不同。研究证明，miRNAs可以作为肝细胞癌分类、预后和早期诊断的生物学标志，并有望成为体内治疗的新靶点。本文对各类miRNAs小分子与肝细胞癌发生的关系，及其在临床上的应用潜能等进行了介绍。

肝细胞癌；MicroRNAs；诊断；治疗

微小RNA（MicroRNAs，miRNAs）是一类内源性单链非编码小分子RNA，广泛存在于各种真核生物中，它的异常表达与恶性肿瘤的发生发展密切相关。研究发现白血病、胃癌、肺癌、乳腺癌等癌症中都有miRNA的异常表达。肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上最常见的癌症之一，在癌症死亡率中位居第三[1]。miRNAs在HCC中作为癌基因或抑癌基因已得到了证实，它对HCC早期诊断、筛查和治疗具有潜在的临床诊疗价值。本文就各类miRNAs小分子与肝细胞癌的关系及其在临床上应用的潜能等进行综述，从而进一步认识肝细胞癌发生的分子机理。

1 miRNA的功能和特点及其在肿瘤发生中的通用机制

miRNAs是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码小分子RNA，其大小长约21-25个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。

最近的研究发现miRNAs参与生命过程中多种调节途径，包括早期发育、细胞增殖和凋亡等，而且miRNAs表达与多种肿瘤相关，在肿瘤发生过程中发挥癌基因和抑癌基因的重要作用。在胃癌中miR-23a表达上调，是一个癌基因，转录后通过靶基因干扰素调节因子1促进细胞增殖和集落形成[2]。Kuo等[3]发现miR-33a是一个潜在的肿瘤抑制基因，miR-33a在肺癌细胞中表达下调，与肺癌病人的预后有关，miR-33a超表达，肺癌病人预后差。此外miRNAs还与癌症进展有关，乳腺浸润性癌中miR-27a明显上调，而且miR-27a的表达与病理变化包括肿瘤大小，淋巴结转移和远端转移明显相关，miR-27a与乳腺癌进展明显相关[4]。

2 miRNAs与HCC

2.1 miRNAs与HCC的发生机制肝癌的发生是多基因参与、多步骤发生的过程。截止2012年8月，人体组织共发现约1600种前体miRNAs，约2042种成熟miRNAs，其中许多都与肝癌相关。研究表明，miRNAs作为癌基因或抑癌基因参与了HCC的发生过程，并且通过其靶基因发挥生物学作用。

在HCC中miR-221、miR-122等的异常表达已有多篇文献报道，每种异常的miRNAs都通过多重靶基因调节，激活多条癌症途径来发挥作用。miR-221在HCC中有70～80%表达上调，是一个明确的癌基因，其靶基因是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27（cyclin-dependent kinase inhibitor，CDKN1B/p27），体外可促进肿瘤细胞生长。用肝癌的老鼠模型显示miR-221超表达可以刺激致瘤的小鼠肝祖细胞生长，说明miR-221是一个癌基因[5]。在分子水平，miR-221通过多重靶基因调节影响了一些通路，研究表明miR-221利用细胞循环原理来控制细胞生长，尤其是细胞循环控制蛋白中miR-221抑制了细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂CDKN1B/p27[6]和CDKN1C/p57[7，8]。

miR-122是一个肿瘤抑制基因，可诱导肿瘤细胞凋亡和阻止细胞周期，抑制体内肝癌细胞株的肿瘤发生[9]。对照癌旁组织miR-122在HCC组织和细胞中显著下调，超表达miR-122显著抑制增殖，促进HepG2和Hep3B细胞凋亡，超表达miR-122还下调蛋白Wnt1、β-catenin和TCF-4的表达水平，表明miR-122在HCC中表达下调，超表达miR-122通过Wnt/β-catenin-TCF信号通路抑制HCC细胞生长[10]。

随着DNA测序技术的进步，利用深度测序技术在许多恶性肿瘤中检测出了miRNAs组的序列，这些非编码小RNAs在肿瘤的形成过程中发挥了越来越重要的作用，但在HCC中非编码小RNAs特别是非编码miRNAs仍是空白。2013年1月，Law等[11]通过DNA深度测序和生物信息学分析，在肝肿瘤形成中发现了一个新的和PIWI蛋白相关联的非编码RNA（piRNA）-piR-Hep1，对照相关的癌旁组织，46.6%HCC肿瘤中有piR-Hep1上调；沉默piR-Hep1则抑制细胞活力及侵袭力，而且伴随AKT磷酸化作用减少。对miRNAs进行分析，发现在HCC中大量表达miR-1323，而且与肝硬化引起的肝癌相关，在肝硬化相关的肝癌中超表达miR-1323与无病生存率和总体生存率相关。

2.2 miRNAs与HCC的侵袭转移miRNAs不仅与HCC发生有关，而且与HCC侵袭转移密切相关。越来越多的研究表明，miRNAs的异常表达与肿瘤的恶变和发展关系密切。Chen等[12]研究了miR-100在HCC中的表达及其与临床病理和预后的关系，同时对miR-100在HCC细胞中生长和凋亡的分子机制进行研究，结果显示miR-100是一个抑癌基因，miR-100在HCC组织中明显低于癌旁组织，同时低表达miR-100与HCC分期、淋巴结转移、TMN分期及高复发率相关，此外，还发现通过下调丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（polo-like kinase 1，PLK1）使miR-100上调，可以抑制HCC细胞生长，增加细胞凋亡，而且miR-100的低表达与HCC临床病理特征和不良预后有关。说明miR-100通过靶基因PLK1发挥肿瘤抑制剂作用，在HCC中可作为预后标志和治疗靶标。

最新研究发现，HCC中miR-140-5p发挥抑制剂的作用，通过靶基因转化生长因子β受体1（transforming growth factor B receptor 1，TGFBR1）和转化生长因子9（transforming growth factor9，FGF9）抑制肝癌的生长和转移。在不同HCC分型中对比miRNA的表达，发现miR-140-5p是HCC相关的一个miRNA，在肝癌组织和肝癌细胞中miR-140-5p明显下调，而且它的表达与多结节形成、静脉入侵和荚膜形成有关，还与无病生存率和总体生存率有关；siRNA法沉默TGFBR1和FGF9的表达，能够模拟miR-140-5p异常表达的肿瘤抑制表型，而TGFBR1和FGF9的高表达则减弱了miR-140-5p对HCC增殖和转移的抑制效应。故在HCC发生发展中miR-140-5p可作为一个有价值的肿瘤预后指标[13]。研究还发现，miR-503可以同时下调FGF2和血管内皮生长因子A（Vascular endothelial growth factor A，VEGFA）两个潜在的血管生成因子。在HCC细胞和原发肿瘤组织中miR-503的表达由于表观遗传机制被抑制，体内外超表达miR-503都可减少肿瘤血管生成，而且缺氧通过缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor，HIF-1α）使miR-503表达下调，表明一个miRNA在癌症中有FGF2和VEGFA两个靶基因，提示miR-503在肿瘤生成中的抗血管生成作用，说明缺氧通过HIF-1α诱导FGF2和VEGFA间接抑制miR-503[14]。另外在高转移潜能的HCC细胞株HCCLM3对照低转移潜能的HCC细胞株MHCC97-L中，miR-503显著下调，这些说明miR-503在HCC肿瘤侵袭转移中发挥肿瘤抑制剂的作用[15]。

2.3 循环miRNAs对HCC的诊断价值循环miRNAs作为生物标志用于病人的早期诊断和随访是近来研究的热点。与HCV相关和不相关的HCC中血清miR-21可作为一个指标[16]。Bihrer等[20]研究了62例慢性丙肝病毒（chronic hepatitis C virus infection，CHC）感染者，29例丙肝病毒感染发展成HCC患者，19例健康对照，提取血清中的miR-21，用miR-16作内参，qRT-PCR方法检测，发现miR-21与HCC组织学分级和分期相关，结果显示CHC病人相对正常人升高，而CHC和CHC相关的HCC病人血清miR-21无明显差别。血清miR-21与组织学活性指数（HAI）、ALT、AST、BIL、国际标准化比率和r-GT相关。血浆miR-21作为HCC的一个新的生物标志，术后比术前明显降低[17]。血清miR-18a在乙肝相关HCC中显著升高，可作为乙肝相关HCC的潜在生物标志[18]。Li等[19]报道了三种miRNAs（miR-25，miR-375和let-7f），而且通过控制可以独立的出现在肝癌中。miR-375有96%特异性100%敏感性。Zhou等[20]研究了七种循环miRNAs，其中四种miRNAs（miR-122，miR-223，miR-26，miR-27a）表达上调，三种miRNAs（miR-192，miR-21，miR-801）表达下调，发现这七种miRNAs是诊断HCC的循环标志物，对诊断HCC有高准确性，特别是对早期巴塞罗那临床肝癌（BCLC）诊断。令人困惑的是，不同研究团队不同的实验设计，以上结果尚存在矛盾的研究结果，在临床使用之前还需大量的实验证明。

2.4 miRNAs在HCC分期和预后分析及在HCC治疗中的价值目前对HCC的分期和预后主要是依据临床指标[21～23]：如肿瘤状态（结节数量和大小，出现血管入侵和肝外扩散）、肝脏功能、有无门脉高压等。miRNAs的表达可以提高我们对HCC分期和预后分析能力，与病理生理和临床参数相联系，可能成为HCC分期和预后的潜在分子标志。Budhu等[24]研究显示20种miRNAs与静脉入侵有关，Budhu等研究的结果可能与HCC的早期分期有关，他们提供了一个更为理性的干预治疗方法。在miRNAs中miR-125b抑制HCC细胞株中细胞生长，高表达时与HCC病人的高生存率有关[25]；miR-122的下调与肝癌患者肝内转移有关，降低miR-122与短时间复发有关[26]；低miR-22表达预示HCC病人低生存率[27]；miR-139是一个转移抑制剂，在转移瘤中发现它下调，miR-139的下调增加了体内HCC细胞的侵袭能力和HCC转移能力，低miR-139病人预后差[28]；在HCC中上调的miRNAs中miR-221 抑制了肿瘤抑制蛋白包括CDKN1B/p27 和CDKN1C/p57的表达，与短期复发率有关[29]。因此，miRNAs单独或者结合其他参数可能成为HCC分期和预后标志。

人类肿瘤发生中分子途径参与的靶基因治疗已经成为肿瘤治疗最理想的方法。目前多重抑制剂索拉菲尼通过阻断VEGFR和血小板衍生生长因子受体（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）已被应用到晚期肝癌的治疗中。HCC中miRNAs的发现使我们对HCC分子机理有了进一步的认识，miRNAs可能成为靶基因治疗的重要手段。Kota和Coworkers[30]通过动物模型成功的证明了miR-26a的抗肿瘤作用。Ji等[31]发现HCC病人中，非瘤肝组织中miR-26a和miR-26b的表达女性比男性高，肿瘤组织中miR-26降低，miR-26降低与NF-κB和Il-6在肿瘤的发展中发挥作用有关，而且低表达的miR-26的病人生存率低。肿瘤在体内用反义寡苷酸进行抗癌治疗也取得了很大进展，用miR-21的反义寡苷酸治疗癌症，许多癌症细胞出现了生长抑制，凋亡增加，而且被反义寡苷酸抑制的miR-21增加了化疗的敏感性[32，19]，可见miRNAs或其反义寡苷酸在癌症的临床治疗上有很大的可行性。

3 展望

综上所述，miRNAs与HCC等肿瘤的发生、发展过程密切相关。研究miRNAs对肿瘤临床的早期诊断、分期、预后、治疗等具有重要意义。虽然对miRNAs在癌症发展方面的认识正在提高，但它仍不完整。特别是几个相关问题需要解决：①在HCC中发现的所有miRNAs对肿瘤的发展都至关重要吗？②为什么不同团队研究的miRNAs结果不可重复甚至相反? ③循环miRNAs的高稳定性可使它们成为完美的生物标志，特别是疾病早期无症状阶段。然而在HCC组织中某些miRNAs和病人血液之间缺乏对应的原因仍不清楚。除此之外，循环miRNAs作为癌症生物标志的可靠性还未经过临床验证。总之，针对许多未解决的问题，进一步了解miRNAs调控肿瘤发生的机制是目前急需解决的问题和挑战，它可能在诊断和治疗癌症方面推动创新概念的发展。

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（收稿：2013-06-19）

（校对：张骏飞）

Progress in microRNAs in the development of hepatocellular carcinoma

PeiLiling，LiJiansheng，RenWeihua. Department of Clinical Laboratory，Anhui Provincial Hospital，Affiliated to Anhui Medical University，Hefei 230001，China

MicroRNAs（miRNAs）are a class of 21 to 25 nucleotides non-coding small RNAs that regulate post-transcriptionally gene expression. Recent findings show that the abnormal expression of miRNAs is closely related to a number of diseases，especially the development of malignant tumor. miRNAs are expressed at different levels in various cancers. Studies shows that miRNAs can be used as biological markers for histological classification，prognosis and early diagnosis of hepatocellular carcinoma，and are expected to become a new therapeutic target in vivo. In this paper，a number of known small miRNAs are reviewed for their effect in carcinogenesis in liver cancer.

Hepatocellular carcinoma；MicroRNAs；Diagnosis；Treatment

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.02.031

安徽省科技攻关项目（01013025）

230001合肥市安徽医科大学附属省立医院检验科（裴丽玲）；肝癌实验室（李建生，任维华）

裴丽玲，女，37岁，硕士研究生，主管检验师。主要从事肝癌早期诊断研究。E- mail：1419869996@qq.com

任维华，E- mail：weihuaren@sina.com