刘建群

脑梗死(cerebral infarction)是神经系统的常见疾病，其主要病理性改变是局部脑组织由于缺氧缺血导致脑组织坏死软化。脑梗死病因多样，往往造成严重后遗症甚至死亡，且有逐年上升的趋势，虽然近年来有多种治疗方法使病死率有所下降，但致残率依然很高，病后患者的生活质量明显下降，给患者家属带来沉重的负担。研究表明脑梗死的发生与多种因素有关，高血压、高血脂、血糖异常都是导致脑梗死的重要原因;吸烟等不良嗜好也是脑梗死的危险因素［1］。但这些原因还不能完全解释脑梗死的病因，许多患者没有上述常见的容易导致脑梗死发生的危险因素，因此遗传因素的作用日益得到重视。胆固醇酯转运蛋白(cholesteryl ester transfer protein，CETP)的主要功能是协助脂质转运，调节机体血脂水平。血浆中受CETP的脂蛋白主要有高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)，CETP可以调节这些脂蛋白的颗粒体积及组成成分［1］。故CETP与脂质代谢关系密切，也是动脉粥样硬化的易感基因之一［2］。脑梗死的直接病因之一就是动脉粥样硬化，因此CETP表达异常可能与脑梗死发生有关，但具体关系相关报道罕见。由于CETP基因多态性与多种疾病有关［3，4］，为了解CETP基因多态性对脑梗死的影响，本研究应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)结合DNA测序方法，对我院诊治的汉族脑梗死患者CETP基因变异情况进行了较为深入的研究，对I405V突变在对照组与脑梗死组的基因频率和基因型频率进行了计算，对CETP I405V突变对脑梗死的影响及其相关性进行了探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2010年7月至2013年6月在河北省迁安市人民医院神经内科住院及门诊诊治的急性脑梗死患者(试验组)，共350例，其中男206例，女144例;年龄42～65岁，平均年龄(48±10)岁。脑梗死均按全国第四届脑血管病会议修订的诊断标准［5］，所有病例均有颅脑CT或MRI证实为脑梗死。选取同期来我院门诊体检的健康人群为对照组，共331例，其中男190例，女141例;年龄34～53岁，平均年龄(47±15)岁，对照组均无心、脑、肝、肾疾病，无糖尿病、甲亢、甲减及近期感染史。所有入选个体均为久居于河北省的汉族人群，均自愿签署知情同意书，并得到河北省迁安市人民医院医学伦理委员会的批准。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集:入选者过夜空腹12 h，于次日采集隔夜空腹静脉血，留取4 ml，置于促凝管中，室温静置30 min后，3 500 r/min离心15 min，分离血清，用于血清指标的测定;另取抗凝血4 ml，迅速置于-80℃保存，用于提取DNA。

1.2.2 血清指标的测定:用酶法检测总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、HDL-c、极低密度脂蛋白-胆固醇(VLDL-c)测定。LDL-c水平按Friedewald公式计算获得(LDL-c=TC-HDL-c-TG/2.2)。采用的仪器为日立全自动生化分析仪7600。

1.2.3 酶联免疫吸附法(ELISA)测定CETP水平:CETP试剂盒E0814h购自武汉中美公司，最小可测人CETP浓度为0.78 ng/ml;板内变异系数、板间变异系数均＜10%。测定方法严格依据试剂盒说明书操作。

1.2.4 实验耗材与设备试剂:TIANamp Blood DNA Kit血液基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)、KOD plus(Pfu DNA聚合酶)、dNTP酶、引物;Biowest Agarose进口分装琼脂糖，DL500TM DNA Marker(Takara);其他试剂为国产分析纯。Mastercycler gradient PCR仪(Eppendorf)，ABI PRISM 377 DNA测序电泳仪(ABI)。

1.2.5 人外周血基因组DNA提取方法:取空腹静脉血(抗凝)4 ml，严格按天根TIANamp Blood DNA Kit血液基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)说明书提取外周血液中基因组DNA。-80℃保存备用。

1.2.6 DNA浓度及纯度测定:吸取5 μl DNA样品加双蒸水至1 ml，混匀后，转入1 ml石英比色杯中于DNA/RNA/蛋白测定仪中测定260 nm，280 nm处的吸光度，DNA/RNA/蛋白测定仪先用1 ml双蒸水校正零点。DNA样品浓度=OD260×200×50(μg/ml)DNA样品纯度=OD260/OD280。

1.2.7 PCR扩增CETP基因14外显子:所用引物分别由上海生工生物工程技术服务有限公司及北京三博远志生物技术有限公司合成。引物序列为上游5’-CTCACCATGGGCATTTGATTGCAGAGCAGCTCCGAC-3’，下游5’-AAAGGTGAAATGGGAAGCTCTGTCAGCCTCGG-3’。PCR反应体系:共25 μl，包括:DNA模板4 μl，上下游引物各2 μl，KOD plus 1 μl，Buffer 2 μl，dNTP Mixture 2 μl，双蒸水12 μl。PCR反应采用降落聚合酶链反应技术(PCR-RFLP)，反应条件见参考文献［6］。所得产物进行特异性检验。

1.2.8 核苷酸序列分析:将CETP基因PCR扩增产物纯化后直接测序，测序方法为双向测序。测序结果用DNAMAN软件(V6.0.3.99汉化版)与GenBank的CETP基因序列进行比对。

1.3 统计学分析 应用SPSS 16.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验;计数资料比较采用χ2检验;OR与95%CI用做评估CETP基因I405V突变位点基因多态性对冠心病脑梗死风险的影响情况。另外采用多变量Logistic回归分析模型在调整性别、年龄、吸烟史、饮酒史、收缩压和舒张压、TC、TG、HDL-C后分析CETP基因I405V位点基因多态性对脑梗死的影响，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组一般情况及CETP浓度的比较2组的年龄、血压无明显差异;试验组血脂指标中TC、TG、LDL-c与对照组比较明显升高，而HDL-c则明显低于对照组(P＜0.05)。试验组患者的吸烟及阳性家族史的比例均高于对照组(P＜0.05)。见表1。

2.2 CETP基因 第14外显子I405V突变位点多态性分析结果PCR产物纯化后送往北京三博远志公司进行双向测序。测序结果发现该位点存在等位基因A和G，基因型分为ⅠⅠ、ⅠⅤ、ⅤⅤ三种类型。见图1。

2.3 CETP基因I405V突变位点基因多态性分析结果CETP基因I405V突变位点等位基因G在试验组的频率为0.5700，明显高于对照组的频率0.3097(P＜0.05)。试验组的GG及AG基因型明显高于正常组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表1 2组一般情况及CETP浓度的比较

图1 CETP基因I405V突变位点多态性分析的测序结果

表2 2组CETP基因I405V位点基因型和等位基因频率分布情况 例(%)

2.4 CETP基因I405V位点与脑梗死的关系CETP基因I405V位点与脑梗死有相关关系，与A/G、A/A基因型相比，G/G基因型能显著增加脑梗死发病风险。OR(95%CI)值 为6.41(4.36～21.88)，调整了性别、年龄、吸烟史、饮酒史、收缩压和舒张压、TC、TG、HDL-c之后OR值为8.27(5.43～32.57)。见表4。

表4 KCTD15基因I405V位点突变与脑梗死的关系

3 讨论

脑梗死是近年来神经系统的常见疾病，致残率与病死率居高不下，而且还有年轻化的趋势，已经引起国内外学者的关注［7］。目前遗传因素是研究的热点，许多学者对脑梗死患者易感基因的多态性展开研究。有研究发现CETP基因与高胆固醇血症关系密切［8，9］，而高胆固醇血症又是脑梗死的主要发病原因之一，但到目前为止有关两者之间关系的研究报道较少，因此我们对CETP基因引起脑梗死的发病机制展开研究。

CETP基因位于16号染色体，包括16个外显子和15个内含子，该基因可以调节血浆胆固醇和TG在HDL与LDL、VLDL之间的交换，CETP基因的这种功能对于调节血浆HDL水平有重要意义，在胆固醇由外周组织运送到肝脏这一过程中发挥重要作用［10］。CETP基因突变与动脉粥样硬化的发生发展关系密切，部分突变可以改变CETP的活性，对脂代谢过程产生影响。本研究发现CETP的浓度在试验组与对照组中存在明显差异，明显高于对照组(P＜0.05)，提示CETP与脑梗死的发生可能有关，这一结论与汪俊军等［11］的研究相符。

CETP基因的I405突变是第14外显子上的错义突变，405Lle→Val(I405V)，即第405位氨基酸的第一个密码子由A突变为G，导致第405位天冬异亮氨酸(Lle)变异为缬氨酸(Val)，这一突变位点靠近脂质转运活性中心，影响了CETP的生物合成，还极有可能影响其生物活性。在我们的研究中，选取了性别年龄相近的试验组和对照组，结果显示CETP基因I405V突变在对照组ⅠⅠ/ⅠⅤ/ⅤⅤ基因型分别占50.8%，36.5%，12.7%，试验组ⅠⅠ/ⅠⅤ/ⅤⅤ基因型分别占24.3%，37.4%，38.3%，试验组ⅤⅤ基因型明显高于对照组，在2组间存在明显差异，同时试验组G等位基因的频率是57%，而对照组的G等位基因的频率是30.97%，试验组明显高于正常对照组。脑梗死是一种受环境与遗传因素共同影响的复杂疾病，本研究中试验组I405V的突变频率明显高于对照组，提示CETP基因的I405V突变可能是引起脑梗死的原因之一，另外CETP基因I405V突变位点G/G基因型引发脑梗死的危险性OR(95%CI)值为6.41(4.36～21.88)，调整了性别、年龄、吸烟史、饮酒史、收缩压和舒张压、TC、TG、HDL-C之后为8.27(5.43～32.57)，明显高于AA/AG基因型，因此进一步验证了CETP基因I405V突变位点与脑梗死的发病风险有显著的相关性。

本研究证实了脑梗死患者血清中CETP浓度高于对照组，且CETP基因I405V突变与脑梗死的发生发展有密切的关系，但其中具体作用机制还有待于进一步研究。

1 Wright RS.Recent clinical trials evaluating benefit of drug therapy for modification of HDL cholesterol.Curr Opin Cardiol，2013，28:389-398.

2 Bochem AE，Kuivenhoven JA，Stroes ES.The promise of cholesteryl ester transfer protein(CETP)inhibition in the treatment of cardiovascular disease.Curr Pharm Des，2013，19:3143-3149.

3 Charles MA，Kane JP.New molecular insights into CETP structure and function:a review.J Lipid Res，2012，53:1451-1458.

4 Ghosh RK，Ghosh SM.Current status of CETP inhibitors in the treatment of hyperlipidemia:an update.Curr Clin Pharmacol，2012，7:102-110.

5 吴逊.全国第四届脑血管病学术会议纪要.卒中与神经疾病，1997，4:105-109.

6 张明明，霍丽静，孙海娟，等.高胆固醇血症患者LL-R基因XspⅠ位点多态性与血清IL-6的关系及意义.临床检验杂志，2011，29:596-598.

7 Sharma VK，Kawnayn G，Sarkar N.Acute ischemic stroke:comparison of low-dose and standard-dose regimes of tissue plasminogen activator.Expert Rev Neurother，2013，13:895-902.

8 Niesor EJ，von der Mark E，Calabresi L，et al.Lipid and apoprotein composition of HDL in partial or complete CETP deficiency.Curr Vasc Pharmacol，2012，10:422-431.

9 Salakhutdinov NF，Rogoza LN，Tolstikov GA.Hypercholesterolemia:chemical aspect of approach.Curr Med Chem，2011，18:4076-4105.

10 Sofat R，Hingorani AD，Smeeth L，et al.Separating the mechanism-based and off-target actions of cholesteryl ester transfer protein inhibitors with CETP gene polymorphisms.Circulation，2010，121:52-62.

11 汪俊军，顾勤花，张春妮.高脂血症人群血清胆固醇酯转运蛋白的水平.中国动脉硬化杂志，2006，14:1038-1040.