邓 园宋 娜刘 名高天翔

(1. 中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所, 青岛 266003; 2. 山东省海洋生物研究院, 青岛 266002)

基于线粒体DNA Cyt b序列的双齿围沙蚕群体遗传多样性分析

邓 园1宋 娜1刘 名2高天翔1

(1. 中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所, 青岛 266003; 2. 山东省海洋生物研究院, 青岛 266002)

双齿围沙蚕(Perinereis aibuhitensis)俗称红虫, 隶属于多毛纲(Polychaeta)、沙蚕亚科(Nereidinae)、围沙蚕属(Perinereis), 是我国潮间带河口泥沙滩上的优势种, 体大且肥, 可做饵料, 也是我国沿海河口增养殖种类之一。该种为热带、亚热带的广布种, 分布于韩国、泰国、菲律宾、印度、印度尼西亚以及我国近海[1]。近年来随着沙蚕的采捕量增大及环境变化, 导致沙蚕资源逐渐匮乏, 影响到其资源的可持续利用与发展[2]。

分子标记是物种遗传差异的表现, 可以用来有效检测物种遗传多样性和遗传结构[3,4]。在所有的分子标记中,线粒体DNA具有严格遵守母系遗传、几乎不发生重组、进化速度快等特征, 已被广泛应用于种间水平和种内水平物种遗传多样性及遗传结构研究[5]。而线粒体DNA Cyt b在无脊椎动物中, 具有较高的核苷酸替代速率, 是研究群体水平遗传多样性比较理想的分子标记[6]。目前为止,线粒体DNA Cyt b基因已被应用于刺沙蚕属(Neanthes)、荷沙蚕属(Hediste)、Marenzelleria等海洋多毛类的遗传多样性和遗传结构的研究[7,8]。除此之外, DNA序列中的多态数量和分布模式也可为推测种群历史提供动态信息,进而探讨其产生和维持的机制[6,9]。

到目前为止, 对双齿围沙蚕的研究主要集中在其生活史、性腺发育的组织学、生态和生态因子对其早期发育的影响等方面[10—13]。种群遗传学方面仅有Liu, et al.基于线粒体DNA COⅠ部分片段研究了双齿围沙蚕4个群体的遗传多样性及遗传结构现状[14], 蒋霞敏等进行了双齿围沙蚕遗传多样性的随机扩增多态分析[15]。迄今, 未见其他关于双齿围沙蚕遗传多样性研究的报道。开展双齿围沙蚕种质资源遗传学研究对合理保护及开发这一重要经济物种具有极其重要的意义。

多毛纲大多数沙蚕种类在性成熟时, 在一定时期内同步地离开栖息地, 由底栖起浮于海面游动以排精放卵,此生殖习性称为群浮[16]。双齿围沙蚕的的群浮现象多出现在每年的4月下旬至10月下旬, 雌雄虫常相伴做圆形的旋转游动, 在旋转缠绕过程中排精放卵。沙蚕的群浮保证精卵相遇而受精, 自由浮游的沙蚕幼虫, 可随潮流或海流达远而广的分布[1]。沙蚕的群浮现象可能会影响多毛类群体的遗传结构及遗传多样性[7]。本研究基于线粒体DNA Cyt b分子标记对采自中国东营和青岛的双齿围沙蚕进行遗传学研究, 以阐明其群体遗传结构和遗传多样性现状, 探讨其产生原因和维持机制, 为双齿围沙蚕的资源保护及合理的资源开发提供基础资料和科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集与保存

于2011年8月在山东青岛近海潮间带采集双齿围沙蚕野生群体34个个体, 于2012年5月在山东东营近海潮间带采集双齿围沙蚕野生群体31个个体。经形态鉴定以后, 取样品体节肌肉于95%的酒精中保存备用。选择多齿围沙蚕(Perinereis nuntia)作为外群进行遗传学分析。

1.2 DNA提取与PCR扩增

取双齿围沙蚕肌肉组织约 100 mg采用传统的酚-氯仿方法提取基因组DNA, 将乙醇沉淀后的基因组DNA溶解于100 µL双蒸水溶液中, 4℃保存备用[6]。双齿围沙蚕的Cyt b序列扩增引物为Cyt bF(5′-GGWTAYGTWYTWCC WTGRGGWCARAT-3′)和 Cyt bR(5′-GCRTAWGCRAAW ARRAARTAYCAYTCWGG-3′)[17], PCR反应体系总体积为25 μL, 其中包括: 10×PCR缓冲液2.5 µL, dNTP 2 µL (200 µmol/L); 两种引物个1 µL (10 pmol/µL); TaqDNA聚合酶0.15 µL (5 U/µL); 模板DNA 1 µL; 加双蒸水至总体积25 µL。PCR反应条件如下: 94℃预变性5min, 然后进行35个循环, 每个循环包括94℃变性45s, 50℃退火45s, 72℃延伸45s, 最后72℃延伸10min。所有的PCR反应均在Eppendorf (Mastercycler 5333)扩增仪上进行[18]。

取1.5 μL PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测, 对于扩增效果良好的样品进行回收。回收时用 1.5%的琼脂糖凝胶, 150V电压电泳分离, 用小量胶回收试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)进行回收和纯化。将纯化后的产物送往上海桑尼生物科技有限公司进行测序, 为保证所测序列的准确性, 每个样品均进行双向测序。

1.3 数据分析

对两个群体的序列用DNAStar(DNASTARInc)软件进行比对, 并辅以人工校正; 用 MEGA4.1软件分析两群体的碱基组成、变异位点、转换/颠换值; 运用 PAUP和 Modeltest软件计算得到适合双齿围沙蚕 Cyt b片段的核苷酸最佳替换模型; 采用PAUP软件, 以多齿围沙蚕为外群, 构建双齿围沙蚕邻近关系树。采用 Arlequin3.0软件计算群体遗传学参数; 单倍型多样度(h)、核苷酸多样度(л)和两两序列比对平均核苷酸差异数(k); 进行确切P检验,并计算两个群体间的Fst值检验群体遗传分化。采用中性检验和核苷酸不配对分布分析两种方法检测群体历史动态, 上述两种方法均在Arlequin3.0软件中完成。

2 结果

对双齿围沙蚕东营和青岛共65个个体进行PCR扩增得到长度为375 bp的序列片段, 基于Cyt b序列对两个群体进行比较分析结果显示: 青岛群体34个个体共检测到20个多态位点, 这些多态位点共定义了20处核苷酸替换, 包括 18处转换和 2处颠换, 共定义了20个单倍型;东营群体31个个体共检测到13个多态位点, 这些多态位点共定义了13处核苷酸替换, 包括9处转换和4处颠换,共定义了14个单倍型。青岛群体的单倍型多样度、核苷酸多样度以及两两序列比较的平均碱基差异数均大于东营群体(表 1)。两个群体的 A+T碱基含量(63.7%)都明显大于 C+G含量(36.4%), 且无明显差异。通过 PAUP和Modeltest软件计算得到双齿围沙蚕最佳替换模型为HKY+I+G(I=0.8821, G=1.0392)。

以多齿围沙蚕为外群, 基于双齿围沙蚕青岛和东营群体Cyt b序列构建的邻接关系树可以看出, 青岛和东营群体个体相互混杂, 且有共享单倍型, 两群体的单倍型都广泛的分布在单倍型的邻接关系树上, 没有明显的分支与之对应(图1)。两个群体之间的遗传分化指数Fst值为0.0175, 统计检验 P值为不显著(P=0.0966), 表明两个群体之间的遗传差异不显著, 确切 P检验的结果表明两群体存在随机交配的现象(P=0.1182)。

表1 双齿围沙蚕的遗传多样性参数Tab.1 Molecular diversity indices for P. aibuhitensis based mtDNA Cyt b

双齿围沙蚕核苷酸不配对分布呈单峰状态(图2), 且观测值没有明显偏离模拟值, Fs和D中性检验的结果与核苷酸不配对分布分析的结果也是一致的(Tajima’ D=–1.9136, P=0.005; Fs= –27.0956, P=0.0000), 都显著偏离中性, 提示双齿围沙蚕经历过近期群体扩张事件。核苷酸不配对分布的峰值 τ提供了一个估算群体大致发生扩张的时间, 将每百万年2%—5%的Cyt b进化速率应用于本研究[19], 基于核苷酸不配对分布的τ值(τ=2.62109)计算得到双齿围沙蚕群体扩张时间在130000—69000YBP。

图1 以多齿围沙蚕为外群构建的双齿围沙蚕Cyt b单倍型邻接关系树Fig. 1 Neighbor-joining tree for control region haplotypes of P. aibutitensis and P. nuntia served as an outgroup

图2 双齿围沙蚕线粒体Cyt b单倍型核苷酸不配对分布图Fig. 2 Mismatch distribution analyses of nucleotide of mtDNA Cyt b genes for P. anbutitensis populations

3 讨论

物种遗传多样性水平的高低与其适应能力、生存能力和进化潜力存在密切的相关性[6,19]。物种遗传多样性越高或遗传变异越丰富, 对环境变化的适应能力就越强[20];反之, 具有较低遗传多样性的物种则更容易受到环境变化的影响[6,21]。目前, 对一些海洋无脊椎动物研究表明,海洋无脊椎动物的幼体发育模式和浮游能力对其遗传结构及其遗传多样性的影响也是非常显著的[22,23]。因此对物种遗传多样性的研究, 除了可以研究物种的进化历史,也可以为分析物种的进化潜力和预测物种发展动向提供重要的依据[6]。

更新世冰期剧烈的气候变化对很多物种的分布范围造成了巨大影响[3—6], 冰期海平面下降而成为陆地, 冰盛期海平面下降了约120—140 m, 中国沿海的浅海陆架区也因海平面下降而成为陆地, 将亚洲大陆与太平洋隔离[24—26]。双齿围沙蚕的栖息地环境受到了极大的影响, 在其分布范围内栖息地急剧缩减, 随着间冰期的气温回升和海平面上升, 双齿围沙蚕可能发生群体扩张事件[6], 而核苷酸不配对分布的单峰也提示双齿围沙蚕可能经历了近期的群体扩张事件。本研究中双齿围沙蚕发生群体扩张事件的时间在 130000—69000YBP, 这一时间处于晚更新世冰期,提示更新世冰期的气候变化对双齿围沙蚕的数量和分布可能产生过影响[6]。

除历史因素的影响, 多毛类的生活史特征对其群体遗传多样性及遗传结构的影响也是很重要的。Breton, et al.基于线粒体DNA COⅠ和Cyt b分析了北半球分布的两种沙蚕(Neanthes virens and Hediste diversicolor), 结果显示沙蚕的群浮现象及浮游期影响其种群的遗传结构[7]。双齿围沙蚕在性成熟之后会变成异沙蚕体, 并从底栖生活改为浮游, 快速游动一定时间后, 产卵排精。双齿围沙蚕的群浮周期与水温、潮汐和昼夜变化等外界条件紧密相关[11]。这些外界条件都可以间接的影响双齿围沙蚕不同地理群体之间的基因交流。自由浮游的沙蚕幼虫, 可随潮流或海流达远而广的分布[1]。且双齿围沙蚕的的异沙蚕体多出现在每年夏季风盛行的时候[27], 沙蚕幼虫在中国沿岸流的输送下, 由北向南广泛分布。因此, 海洋环流对双齿围沙蚕群体之间的基因交流有很重要的作用。研究得出青岛群体的双齿围沙蚕的单倍型多样度和核苷酸多样度略高于东营群体, 这与青岛胶州湾的复杂的地形地貌以及海流状况可能存在一定关系[14]。

在Liu, et al.的研究中, 基于线粒体COⅠ序列在4个地理群体的93个个体中, 共检测到26个单倍型。在本研究中, 基于线粒体Cyt b序列在2个地理群体的65个个体中共检测到30个单倍型。提示双齿围沙蚕的线粒体Cyt b片段可能较 COⅠ片段更敏感, 更适合用于群体遗传分化研究[7, 8]。

总之, 更新世冰期的气候变化对现有双齿围沙蚕的群体遗传结构产生了重要的影响, 而幼体的扩散能力促进了不同群体间的基因交流。随着资源的开发利用, 双齿围沙蚕可能会承受较大的采捕压力, 本研究对其制定合理的管理策略提供了一定的理论依据[26]。

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POPULATION GENETIC ANALYSIS OF PERINEREIS AIBUHITENSIS BASED ON THE MITOCHONDRIAL DNA CYT B

DENG Yuan1, SONG Na1, LIU Ming2and GAO Tian-Xiang1
(1. Institute of Evolution & Marine Biodiversity, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. Marine Biology Institute of Shandong Province, Guizhou Road 47, Qingdao 266002, China)

双齿围沙蚕; Cyt b; 群体遗传结构; 遗传多样性; 群体扩张

Perinereis aibuhitensis; mtDNA Cyt b; Genetic structure; Genetic diversity; Population expansion

Q346.5

A

1000-3207(2014)03-0597-05

10.7541/2014.85

2013-9-24;

2013-12-28

海洋公益性行业科研专项(201305043; 201405010); 山东省海洋与渔业厅科技计划项目资助

邓园(1987—), 女, 河南省汤阴县人, 硕士; 主要从事水生生物系统发育与遗传多样性研究。E-mail: 765071558@qq.com

高天翔, E-mail: gaozhang@ouc.edu.cn