郑炜炜 宋 革 钟小英 张清健 祝晓丽 谭玉梅 姜荣华

广东省计划生育科学技术研究所，广东省计划生育专科医院生殖医学中心（广州，510060）

供精人工授精（AID）是通过非性交方式将供者精液置于女性生殖道内，以期精子与卵母细胞自然结合，达到妊娠目的而采取的一种辅助生殖技术。随着精子冷冻技术的日益成熟，人类精子库的相继成立，AID技术得以广泛应用。该项技术在给人们带来福音的同时也带来了挑战，其安全性值得关注。本研究通过对2007年4月～2013年4月在本中心实施AID助孕者的临床资料进行总结分析，探讨冷冻精液冻存时间对AID结局及子代安全性的影响。

1 资料与方法

1.1 对象与分组

2007年4月～2013年4月在广东省计划生育专科医院实施AID助孕的6038对夫妇共14290个AID周期的临床资料。女方年龄20～45（29.59±4.06）岁，不孕年限1～22（4.96±3.14）年。全部病例符合国家卫生计生委关于辅助生殖技术规范的要求，具备AID适应证，排除禁忌证后实施AID治疗。按供精精液冻存时间分为0.5～1年，＞1～3年，＞3～5年，＞5～7年和＞7～10年5组。

1.2 精液来源和质量控制

精液来源于广东省计划生育专科医院人类精子库和浙江省计划生育研究所人类精子库。精液冷冻储存时间为0.5～10年，选择宫颈内人工授精（ICI）术式时前向运动精子总数≥20×106，选择宫腔内人工授精（IUI）术式时前向运动精子总数≥10×106。若精液处理后不达标则需重新追加供精标本。

1.3 卵泡监测和AID手术时机

采用阴道超声诊断仪（Aloka－SSD1400）连续监测卵泡发育和子宫内膜情况，结合尿黄体生成素（LH）、宫颈黏液，以及性激素测定等方法确定排卵时间，选择授精时机。月经规则，排卵正常者行自然周期人工授精；卵泡发育不良、排卵障碍或多个自然周期助孕失败者使用个体化的方案诱导排卵，药物包括氯米芬、他莫昔芬、来曲唑、人绝经期促性腺激素、卵泡刺激素和人绒毛膜促性腺激素（hCG）。

1.4 人工授精及随访

当优势卵泡直径＞18mm，子宫内膜厚度≥7 mm，尿LH 峰出现，或注射hCG 6500～10 000U后24～36h行首次人工授精，超声确认排卵后再次行人工授精。每个周期常规授精2次，个别病例在排卵前或排卵后行单次授精，或围排卵期授精3次。AID术后常规给予黄体功能支持。术后第10个月追踪新生儿情况，包括分娩孕周、分娩方式、新生儿体重、性别和健康状况等。

1.5 AID治疗成功的诊断标准

AID术后第14～16天若无月经来潮（注射hCG者需停药超过7d），血 －hCG＞5U／L或尿hCG检测（＋）为生化妊娠，术后第30～35天超声检查发现孕囊为临床妊娠，确定妊娠位置、孕囊数和活胎数。

1.6 统计学处理

采用SPSS18.0软件包对资料进行统计分析，正态分布计量资料采用方差分析，计数资料采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 供精精液冻存时间与AID结局及子代出生缺陷的关系

不同精液冻存时间组前向运动精子总数无统计学差异（P＞0.05），各组临床妊娠率、流产率无统计学差异（P＞0.05）；2794例临床妊娠中共发生子代出生缺陷33例（包括胎儿畸形引产8例），出生缺陷率为1.33%，各组出生缺陷发生率无统计学差异（P＞0.05）。见表1。

表1 供精精液冻存时间与AID结局及子代出生缺陷发生率的关系

2.2 子代出生缺陷发生情况

将33例出生缺陷进行分类，结果显示先天性心脏畸形比例最高（10／33），其次是唇腭裂（7／33）和先天性脑积水（3／33）等，其他畸形包括先天性胆道闭锁、肛门闭锁、多指畸形等15种。33例出生缺陷中8例在妊娠28周前实施引产术，引产儿均具有医学指征，分别为重度唇腭裂1例、胎儿肺囊腺瘤1例、胎儿淋巴水囊瘤1例、唐氏综合征2例、胎儿心脏畸形3例。已出生的25例出生缺陷患儿中有2例合并2处出生缺陷，分别为先天性心脏病合并脑积水和先天性心脏病合并胆道闭锁，均于出生后2d内死亡；2例脑积水患儿出生后死亡；1例先天性胆道闭锁患儿出生后6个月死亡，其余出生缺陷儿均存活。33例出生缺陷均发生于不同编号的供精精液，出生缺陷多发生在供精精液冻存时间为0.5～3年，不同精液冷冻时间组出生缺陷发生率并无统计学差异（P＞0.05）。见表2。

表2 ADI助孕子代出生缺陷类型在不同精液冻存时间组的分布（例）

3 讨论

精液冷冻是辅助生育中的重要技术之一，精液冷冻技术结合人工授精所进行的AID为无精子症以及先天性遗传疾病不育患者带来福音。然而，冻融后的精液质量以及冻存时间的长短是否会对AID结局和子代的健康造成影响仍令人担忧。在精子冻存过程中，各种因素不仅可以破坏精子的物质结构，而且还影响精子的功能。因此评估精液冷冻后的受精能力及子代安全性十分必要。

精子冷冻实际上是精子脱水，同时冷冻保护剂渗入精子内取代水分的过程。目前的研究认为冷冻过程中冰晶形成是造成精子结构受损和丧失活动力的关键。冰晶形成将细胞局限在一个狭窄空间内，造成精子膜受损、精子微结构变化、精子DNA断裂、精子线粒体功能及结构受损，而这些变化不仅影响到精子活动力，同时也影响到精子受精能力及精子遗传物质的稳定性，严重者可能导致精子DNA链断裂，影响受精能力或导致早期妊娠流产［1］。国内外均无关于精液冷冻储存时间的管理条例，冷冻精液储存时间长短对受精能力的影响也少有报道。Clarke等［2］采用精子顶体反应和透明带结合试验对在液氮中储存28年的精子进行功能测试，证明长时间的储存并未损伤精子功能。Yogev等［3］也证明精子液氮冷冻储存0.5～14.4年，并不改变其前向运动总数，而前向运动精子总数被认为是评估AID妊娠率的最重要参数［4］。本研究中采用的精子冻存时间为0.5～10年，比较各时间段前向运动精子总数及临床妊娠率，认为冻存时间的长短并不影响其受精能力，与上述报道一致，且临床妊娠率为19.55%，与普通人群自然受孕率类似。普通人群自然流产约占全部妊娠的10%～15%，且多数为早期流产（＜12孕周）［5］。文献报道AID助孕后流产率为 6.79% ～ 17.70%［6－7］，本 研 究 流 产 率 为12.88%，且多为早期流产，与文献报道一致。在本研究中观察到随着冻存时间延长，其流产率有下降趋势（P＞0.05），分析其原因可能是长时间冻存精液的AID周期较少所致，如精液冻存时间在＞7～10年共计22周期，妊娠6例，无流产发生。

目前我国出生缺陷发生率为5.6%，每年新增出生缺陷90万例。我国出生缺陷监测（监测期为满28孕周至出生后7d）数据表明，2000～2011年先天性心脏病、多指（趾）、唇裂伴或不伴腭裂、神经管缺陷、先天性脑积水等是我国围产儿前10位高发畸形［8］。国外一项关于AID助孕后妊娠11 535个周期的研究显示，自然流产率为17.7%，出生缺陷发生率1.7%（包括新生儿和引产的胎儿）［7］。Hoy等［9］报道澳大利亚1552例AID助孕后出生缺陷发生率3.6%。本研究中出生缺陷发生率为1.33%，出生缺陷的种类主要为先天性心脏病、唇腭裂和先天性脑积水等，与国内外的研究报道一致。本研究出生缺陷发生主要集中在精液冻存时间为0.5～3年，与该时间段AID周期数多，妊娠例数多有关。精液冻存＞5～10年总共妊娠25例，出生缺陷发生率为0，符合AID出生缺陷率发生概率。出生缺陷的发生受多种因素的影响，如夫妇双方职业，不良生活习惯，孕妇孕期的饮食、用药，环境因素等。对出生缺陷病例进行详细的随访和分析发现，33例出生缺陷均发生于不同编号的供精精液，这些精液用于其他妇女AID，并未发生出生缺陷，孕期也无特殊状况发生。

本研究显示冷冻精液用于AID安全有效，冻存时间的长短并不影响AID的妊娠率、流产率和子代出生缺陷率。由于本研究中长时间储存精液样本量较少，最长冻存时间仅为10年，并且对辅助生殖技术安全性的评估需要长期临床观察和追踪随访。因此，本研究存在一定的局限性，期待着更大样本量，更长时间的前瞻性研究对该问题进行深入细致地探讨。

［1］ Thomson LK，Fleming SD，Aitken RJ，et al.Cryopreservation－induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis［J］.Hum Reprod，2009，24（9）：2061－2070.

［2］ Clarke GN，Liu DY，Baker HWG.Recovery of human sperm motility and ability to interact with the human zona pellucida after more than 28years of storage in liquid nitrogen［J］.Fertil Steril，2006，86（3）：721－722.

［3］ Yogev L，Kleiman SE，Shabtai E ，et al.Long－term cryostorage of sperm in a human sperm bank does not damage progressive motility concentration［J］.Hum Reprod，2010，25（5）：1097－1103.

［4］ Freour T，Jean M，Mirallia S，et al.Predictive value of CASA parameters in IUI with frozen donor sperm［J］.Int J Androl，2009，32（5）：498－504.

［5］ 丰有吉，沈铿.妇产科学［M］.北京：人民卫生出版社，2005：64－67.

［6］ 王海燕，乔杰，刘平，等.供精人工授精与供精体外受精胚胎移植的临床结局［J］.中国优生与遗传杂志，2007，15（3）：87－89.

［7］ Thepot F，Mayaux MJ，Czyglick F，et al.Incidence of birth defects after artificial insemination with frozen donor spermatozoa：a collaborative study of the French CECOS Federation on 11535pregnancies［J］.Hum Reprod，1996，11（10）：2319－2323.

［8］ 中华人民共和国卫生部.中国出生缺陷防治报告（2012）［R／OL］.［2012－09－12］.http：／／www.gov.cn／gzdt／2012－09／12／content＿2223371.htm.

［9］ Hoy J，Venn A，Halliday J，et al.Perinatal and obstetric outcomes of donor insemination using cryopreserved semen in Victoria Australia［J］.Hum Reprod，1999，14（7）：1760－1764.