吴桂平 付 鑫* 张彦红 邹慕蔚 邓会明 晏 宁

（沈阳医学院附属第二医院心内科，辽宁 沈阳 110035）

MAPK对RBP4诱导炎性反应的调节机制及研究

吴桂平 付 鑫* 张彦红 邹慕蔚 邓会明 晏 宁

（沈阳医学院附属第二医院心内科，辽宁 沈阳 110035）

目的 探讨MAPK对视黄醇蛋白4（RBP4）诱导炎性反应的调节机制。方法 利用大鼠胸主动脉内皮细胞作为研究对象，首先检测了RBP4对白细胞介素-2、白细胞介素-6以及TNF-α的mRNA水平的调节作用，其次，通过PI3K特异性抑制剂（wortmannin）作用下，检测PI3K的mRNA水平，同时检测RBP4对白细胞介素-2、白细胞介素-6以及TNF-α的mRNA水平的调节作用变化。结果 RBP4能够显著上调白细胞介素-2、白细胞介素-6以及TNF-α的mRNA水平（P＜0.05）。在wortmannin作用下，PI3K的mRNA水平显著下调，白细胞介素-2、白细胞介素-6以及TNF-α的mRNA水平显著下调（P＜0.05）。在过表达PI3K病毒作用下，白细胞介素-2、白细胞介素-6以及TNF-α的mRNA水平显著上升（P＜0.05）。结论 本实验初步研究得出MAPK对RBP4诱导的炎性反应具有调节作用。

视黄醇蛋白4；MAPK；PI3K；炎性反应

视黄醇蛋白-4（RBP4）是负责转运维生素A的载体蛋白，在正常状态下，RBP4主要产生于肝脏，但脂肪组织也会产生RBP4[1]。有研究显示，在2型糖尿病中发现RBP4水平显著上升。临床调查显示，RBP4在血液中的含量与心血管疾病风险因子低密度脂蛋白（LDL）也有紧密的关系。动脉粥样硬化疾病的发病机制目前尚未解决，但当前的研究发现，该疾病的初期具有血管内皮炎性反应的症状。动脉粥样硬化前期，RBP4能够诱导血管内皮细胞的炎性反应，而PI3K/ MAPK信号通路在血管内皮细胞的炎性反应、增殖等方面均具有关键作用，本实验在此基础上，旨在研究MAPK对RBP4诱导炎性反应的调节机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

原代培养大鼠胸主动脉内皮细胞在10%胎牛血清的DMEM培养基，37 ℃，5% CO2待传至4～6代则用于实验。

1.2 试剂及仪器

Trizol（Invertrogen），SYBR Green（Toyobo），反转录试剂盒（Toyobo），0. 25% 胰酶（上海生工）、新生牛血清（维森特）、细胞孵育箱（THERMO公司）、超净工作台（安泰）、SD大鼠（ 南京青龙山）。

1.3 RNA 提取

取传至4～6代大鼠胸主动脉内皮细胞，吸弃培养液，添加1 mL冰浴PBS，利用移液器反复轻微吹打细胞，致细胞脱落，1000 rpm/min离心细胞收取，转至1.7 mL离心管，加入1 mL Trizol溶液，加入0.2 mL氯仿。Vortex混匀，5 min室温静置，然后11000 rmp离心，时间为15 min。将上层的水相转入到1.5 mL EP管，添加等体积异丙醇，Vortex混匀，然后放于-20 ℃冰箱中，过0.5 h后，11000 rmp离心，10 min。小心把上清倒掉，保留沉淀。添加1 mL 75%的乙醇，然后洗涤RNA沉淀，最后7000 rmp离心6 min。弃上清，静置5 min。

1.4 RT-PCR

NanoDrop定量后按照TOYOBO 的RT-PCR试剂盒说明书进行。

反转录反应条件：37 ℃ 25 min（RT-PCR反应）；85 ℃ 5 s（酶失活反应）。

1.5 实时荧光定量Q-PCR

用Primer Premier 5.0的软件设计、并合成了相关基因引物，上海博尚生物技术有限公司合成引物，其特异性利用融解曲线进行分析验证。cDNA表达丰度采用Ct值进行检测，β-actin的Ct值作为内参。反转录结束之后，利用SYBR Green（Toyobo）按说明书进行荧光定量PCR。

1.6 统计学处理

采用SPSS软件进行统计处理。所有数据采用mean±SE显示，实验组与对照组之间的差异比较，用两样本的均数t检验，P＜0.05定为统计学上显著性的差异。

2 结 果

2.1 RBP4诱导大鼠胸主动脉血管内皮细胞发生炎性反应

实验组以4 μg/mL的RBP4加入DMEM培养基孵育大鼠胸主动脉血管内皮细胞5 min，然后换用无RBP4的DMEM培养基培养1 d后，进行RNA抽取及荧光定量PCR。对照组加入等量的生理盐水孵育5 min，然后换用无RBP4的DMEM培养基培养1 d后，进行RNA抽取及荧光定量PCR。表1结果显示，相比于对照组，实验组的炎性基因白细胞介素-2、白细胞介素-6以及TNF-α均显著上调，具有统计学差异（P＜0.05）。

表1 两组炎性基因mRNA表达的对比情况（）

表1 两组炎性基因mRNA表达的对比情况（）

注：与对照组比较，*P＜0.05

组别 IL-6 IL-2 TNF-α对照组 1.0±0.1 1.1±0.1 0.9±0.1实验组 4.1±0.1* 3.9±0.2* 5.2±0.2*

2.2 PI3K抑制剂减弱了RBP4对血管内皮细胞炎性反应

实验组添加10 mmol/L的PI3K抑制剂于大鼠胸主动脉内皮细胞孵育10 min，然后以4 μg/mL的RBP4加入DMEM培养基孵育大鼠胸主动脉血管内皮细胞孵育5 min，换用无RBP4的DMEM培养基培养1 d后，进行RNA抽取及荧光定量PCR。模型组参照2.1的实验组加药方法。对照组参照2.1对照组的加药方法。表2结果显示，相比于对照组，实验组的炎性基因白细胞介素-2、白细胞介素-6以及TNF-α均显著上调，具有统计学差异（P＜0.05）。

表2 三组炎性基因mRNA表达的对比情况（）

表2 三组炎性基因mRNA表达的对比情况（）

注：与对照组比较，*P＜0.05

组别 IL-6 IL-2 TNF-α对照组 1.1±0.2 1.0±0.2 1.0±0.2模型组 4.2±0.3 3.8±0.1 4.8±0.1实验组 1.4±0.1* 1.4±0.1* 1.5±0.1*

2.3 过表达PI3K病毒增强了RBP4对血管内皮细胞炎性反应

实验组添加PI3K过表达病毒5 μL于大鼠胸主动脉内皮细胞孵育24h，然后以4μg/mL的RBP4加入DMEM培养基孵育大鼠胸主动脉血管内皮细胞孵育5min，换用无RBP4的DMEM培养基培养1天后，进行RNA抽取及荧光定量PCR。模型组参照2.1的实验组加药方法。对照组参照2.1对照组的加药方法。表3结果显示，相比于对照组，实验组的炎性基因白细胞介素-2、白细胞介素-6以及TNF-α均显著上调，具有统计学差异（P＜0.05）。

表3 三组炎性基因mRNA表达的对比情况（）

表3 三组炎性基因mRNA表达的对比情况（）

注：与对照组比较，*P＜0.05

组别 IL-6 IL-2 TNF-α对照组 1.0±0.3 1.0±0.1 0.9±0.1模型组 4.1±0.2 3.6±0.3 4.9±0.3实验组 7.0±0.3* 6.0±0.2* 6.8±0.2*

3 讨 论

RBP4是一种炎性糖蛋白，通过提高趋化性，细胞附着和细胞 迁移和重组，组织结构重塑，参与到血管内皮功能障碍中来，作为对血管内皮细胞受损的反应。RBP4的蛋白表达可见于动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞和平滑肌细胞，在动脉粥样硬化损伤的早期以最高表达见于巨噬细胞中[2]。内皮功能障碍和动脉粥样硬化中的RBP4参与炎症和动脉过程，表明RBP40有可能在内皮功能障碍和动脉粥样硬化中起作用。这些在体外的根瘤形成过程模仿一些在体内变化的特点，这些变化发生在受伤后的VSMCs中，在这里媒介平滑肌细胞分化，迁移和作用于再狭窄和内膜的形成过程[3]。在体外还研究发现，RBP4促进血管内皮细胞的趋化性，细胞黏着，扩展和迁移，这表明RBP4在动脉粥样硬化斑块形成过程中起作用，在这一过程中平滑肌细胞被诱导迁移过内膜，作为对外源信号的反应。RBP4也通过促进分支小管的形成来调整血管内皮细胞的形态，表明RBP4通过激发VSMCs的迁移和重组在血管再生术中起作用[4]。这些在体外的研究有免疫组织化学的分析作支持，它们揭示了体内RBP4在人体动脉粥样硬化斑的平滑肌细胞中的蛋白表达。一些研究表明，提高血清中RBP4含量水平独立地关联于冠心病的出现及其程度，甚至发现在有心肌梗死的患者病例中含有更高水平的RBP4。另外还发现，提高血清中RBP4含量除了与心血管死亡有关外，还与其他各种原因有关。最后，在1型和2型糖尿病患者中也发现了RBP4含量的升高，与非糖尿病人群相比，这增大了患心血管疾病的风险。在1型糖尿病患者中，提高RBP4循环和蛋白尿之间的正相关，表明了RBP4在进行性血管损伤导致微脉管疾病中的作用。

综上所述，MAPK能够介导RBP4对血管内皮细胞的炎性反应，为今后研究动脉粥样硬化的发生机制提供了一定的理论和实验基础。

[1] Erikstrup C,Mortensen O,Pedersen BK.Retinol-binding protein 4 and insulin resistance (letter to the editor)[J]N Engl J Med,2006,23 (355):1393-1394.

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The Regulation of MAPK on the Inflammatory Response induced by RBP4

WU Gui-ping, FU Xin, ZHANG Yan-hong, ZOU Mu-wei, DENG Hui-ming, YAN Ning
(Department of Cardiology, Shenzhou Hospital Affiliated to Shenyang Medical College, Shenyang 110035, China)

Objective To explore the mechanisms of regulation of MAPK on the inflammatory response induced by retinol protein 4 (RBP4). Methods The rat aortic endothelial cells as an object of study, first detected RBP4 dialogue interleukin-2, the regulatory role of interleukin-6, and TNF-α mRNA levels, and secondly, the role of PI3K specific inhibitor (wortmannin) , the detection of mRNA levels of PI3K simultaneous detection of the changes of the regulatory role of RBP4 interleukin-2, interleukin-6 and of TNF-α mRNA levels. Results RBP4 significant upregulation of interleukin-2, interleukin-6, as well as of TNF-α mRNA levels (P＜0.05). Wortmannin role of PI3K mRNA level significantly lowered, interleukin-2, interleukin-6 as well as of TNF-α the mRNA level significantly significantly lowered (P＜0.05) in the over-expression of PI3K virus, interleukin-2, interleukin prime -6, and TNF-α mRNA levels increased significantly (P＜0.05). Conclusions In this study, preliminary studies MAPK-induced inflammatory response of RBP4 has a regulatory role.

RBP4; MAPK; PI3K; Inflammatory

R541.4

：B

：1671-8194（2014）07-0009-02

沈阳市科技计划项目（计划文号：沈科发[2011]21号；项目编号：F11-262-9-41；合同编号：11318）

*通讯作者：E-mail:fuxin678@163.com