叶瑞兴,邱 银,李英伦

(四川农业大学 动物医学院，四川雅安 625014)

现代医学证明，应激是一种全身的非特异性反应，作用频度大或时间过长的应激常致使机体产生全身适应综合征，如机体内环境失衡，出现行为、生理和生化反应的改变[1]。仔猪断奶后第1周常发生断奶应激综合症，会导致仔猪腹泻，死亡率可达20%～30%，严重制约养猪业的发展[2]。仔猪断奶时其肠道功能和结构尚未发育成熟，受营养、心理和环境多种应激因素的影响，机体的免疫系统会被激活，应激超出一定范围可引起机体炎性细胞因子过量释放而导致机体内的Th1/Th2(Th为辅助性细胞)失去平衡，最终导致肠道炎症和机体免疫功能下降。肠道发生炎症时，炎区内聚集的激活的巨噬细胞和肠黏膜中的吞噬细胞耗氧量增加，机体脂质过氧化反应增强，最终加重肠黏膜的损伤[3-4]。因此，有效改善肠黏膜的抗氧化和免疫能力必将对机体产生一定的保护作用。小肠是营养物质消化和吸收的主要器官，而空肠是小肠中最长的肠段。本试验自拟加味二术散(Two Macrocephala Flavored Powder，TMFP)，观察其对断奶仔猪空肠黏膜抗氧化酶活性和免疫力的影响，以探明加味二术散对断奶仔猪空肠黏膜的修复作用，为防治断奶仔猪应激综合症提供有效方剂。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验药品 加味二术散由白术、苍术、丹参、柴胡、陈皮(质量比为5∶4∶2∶2∶2)组成，原药材购买自雅安中药材公司；五味中药经热风循环干燥箱50 ℃烘干 3 h，超微粉碎，过孔径0.150 mm(100目)的筛，密封保存。

1.1.2 供试动物 30日龄断奶仔猪(杜×长×大)45 头，由四川雅安富强养猪场提供。

1.1.3 试 剂 总超氧化物歧化酶(T-SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化氢酶(CAT)活性、丙二醛(MDA)含量测定试剂盒和考马斯亮蓝试剂盒，均购自南京建成生物有限公司。IL-2和SIg A试剂盒，均购自武汉基因美生物公司。

1.1.4 仪器设备 721可见分光光度计，BECKMAN 64R，BIO-RAD microplate reader等。

1.2 方 法

1.2.1 动物分组 试验采用单因素完全随机试验设计，选取30日龄(杜×长×大)断奶的健康仔猪45头，随机分为 3 个处理组，即：空白对照组(饲喂基础日粮)、中药组(饲喂基础日粮中添加质量分数0.3%加味二术散的日粮)、抗生素组(饲喂基础日粮中添加质量分数0.5%硫酸粘杆菌素的抗生素日粮)。每个处理组设3个重复，每个重复5头断奶仔猪。将3个处理仔猪分栏饲养，按基础饲粮中添加的药物成分将3组仔猪编号。

1.2.2 饲养管理 在实验前将所用仔猪舍彻底消毒。舍内保持清洁干燥，通风良好。试验期间，仔猪自由饮水和采食，按常规免疫程序进行免疫。

1.2.3 样品采集及处理 于试验第 7，14和 21天上午10:00，从每个处理组中随机选取 3 头仔猪放血致死，取出内脏，采取空肠中段 25 cm 的肠道，将其用剪刀剖开，用冰的生理盐水冲洗干净后，平铺于准备好的冰盒上，并用滤纸吸干多余的水分。用灭菌的玻片轻轻刮取肠黏膜，分装于准备好的EP管中，立即放入液氮中速冻，之后再转入-80 ℃ 低温冰箱中冻存。将空肠黏膜组织置于已浸泡在冰水内的组织匀浆器内，按1 g加9 mL的比例加入冰的生理盐水进行研磨，研磨好的液体分装到灭菌的5 mL离心管中离心(3 000 r/min，15 min)，取上清液立刻进行测定。

1.2.4 测定指标及方法 总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(T-AOC)及丙二醛(MDA)、IL-2、SIg A含量的测定，均严格按照试剂盒使用说明书操作。

1.2.5 数据处理 使用 SPSS 17.0 分析软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 肠黏膜抗氧化结果分析

T-SOD能清除超氧阴离子自由基(O2-)，保护细胞免受损伤。CAT在一定条件下能直接分解其底物过氧化氢(H2O2)。MDA含量的高低间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度。断奶仔猪肠黏膜抗氧化能力的测定结果见表1。由表1可知，中药组仔猪空肠黏膜中T-SOD酶活力在试验第7和14天显著高于空白组对照组(P<0.05)；在第7，14和21天显著高于抗生素组(P<0.05)。在试验的第7天，中药组仔猪空肠黏膜中CAT活力显著高于空白对照组和抗生素组(P<0.05)，而在试验第14 和21天与空白对照组差异不显著(P>0.05)。中药组仔猪空肠黏膜中的MDA含量在试验第14天显著低于空白对照组和抗生素组(P<0.05)；在第7和21天与空白对照组均无显著差异(P>0.05)；在第7天时显著低于抗生素组(P<0.05)。各组仔猪空肠黏膜中的T-AOC在第7天无显著差异(P>0.05)；在第14天，中药组显著高于空白对照组和抗生素组(P<0.05)；在第21天，中药组显著高于抗生素组(P<0.05)，但与空白对照组差异不显著(P>0.05)。

表1 加味二术散对断奶仔猪空肠黏膜抗氧化能力的影响

2.2 肠黏膜免疫结果分析

断奶仔猪肠黏膜免疫指标的测定结果见表2。由表2可知，中药组仔猪空肠黏膜中IL-2含量，在第14天显著高于空白对照组(P<0.05)，在试验第7和21天与空白对照组无显著差异(P>0.05)；在试验7，14和21天均显著高于抗生素组(P<0.05)。中药组空肠黏膜中SIg A含量，在试验第7天与空白对照组差异不显著(P>0.05)，第14和21天显著高于空白对照组(P<0.05)；在试验7，14和21天均显著高于抗生素组(P<0.05)。

表2 加味二术散对断奶仔猪肠空肠黏膜免疫能力的影响

3 讨 论

肠道不仅是食物消化、吸收和代谢的主要器官，物质代谢和能量代谢非常旺盛，而且是重要的分泌和免疫器官，因此极易受到过量的氧自由基的攻击而发生疾病[5]。断奶应激可导致仔猪肠道菌群失调，有益菌数量降低，条件致病菌尤其是大肠杆菌增殖，粘附在微绒毛上的大肠杆菌分泌大量的内毒素，最终导致肠道发生炎症。巨噬细胞在炎症区聚集、激活，其耗氧量增加，机体抗氧化能力下降，通过一系列反应，产生大量的OH-、O2-及脂质过氧化物，在体内引起脂质过氧化反应，继而对机体产生氧化损伤，并分解出MDA，使细胞膜通透性增强、大量Ca2+内流，通过花生四烯酸代谢，形成具有高度生物活性的炎症介质，最终加重肠黏膜的损伤[3-4]。

中药的功效与其抗氧化作用有密切关系，其中富含多种抗氧化成分，如酸类化合物、黄酮类化合物、皂苷、多糖等，混用几种天然抗氧化剂往往可增加机体抗氧化能力。中药可通过直接清除活性氧自由基、增强抗氧化酶活性、抗脂质过氧化等作用，来维持细胞膜的稳定性，减小DNA损伤，对抗氧化酶系的作用，提高机体的抗氧化能力[6]。构成加味二术散的5味中药均具有抗氧化作用，其丹参中的丹参素、原儿茶醛、咖啡酸均具有抗氧化作用，复方丹参具有较强还原力，能清除DPPH和超氧阴离子自由基[7]；柴胡中的多糖具有抗氧化作用，其可能通过对补体的抑制作用而阻止氧自由基的产生[8]；陈皮中的黄酮具有较强的抑制有机自由基DPPH和羟自由基的抗氧化活性[9]；苍术中的乙酸乙酯可清除DPPH和ABTS自由基[10]。本试验结果显示，中药组仔猪空肠黏膜中T-SOD酶活力在试验第7和14 天显著高于空白对照组；CAT活力在试验的第7天显著高于空白对照组和抗生素组；MDA含量在试验第14天显著低于空白对照组和抗生素组；T-AOC在第14天显著高于空白对照组和抗生素组。以上结果均说明，加味二术散有提高断奶仔猪肠黏膜抗氧化能力的功效。由此笔者推断，加味二术散可通过提高肠黏膜抗氧化功能而减小应激对肠黏膜的损伤作用。

肠黏膜免疫是宿主体内的重要防御系统。有研究显示，应激会影响机体细胞因子的产生和免疫细胞的功能[11-12]。IL-2由Th1细胞产生，在黏膜免疫中起着重要的调节作用[13]，断奶应激会导致仔猪机体内的IL-2水平下降[14-15]。SIg A是胃肠道和黏膜表面主要的免疫球蛋白,对消化道黏膜起着重要的保护作用。肠腔内的SIg A通过结合细菌而将肠道内细菌聚集起来,形成抗原抗体复合物,刺激肠道黏液的分泌，并加速黏液在肠黏膜表面的移动,有助于排除肠道中的细菌和内毒素。因此，SIg A在保护消化道防御机制中起着重要的作用。中药可增强断奶仔猪机体的免疫功能[16]。研究表明，植物多糖类化合物是一种免疫调节剂，可激活免疫细胞，改善机体免疫功能[17]。本试验加味二术散中的白术可增强巨噬细胞的吞噬作用，其糖蛋白可诱导细胞因子的分泌[18-20]，白术多糖具有促进免疫器官和机体生长发育的作用；苍术中的多糖可调节肠黏膜免疫应答[21-22]；丹参中的丹参素可激活单核巨噬细胞分泌炎性细胞因子，从而增强机体的免疫功能[18]。方剂中，丹参中的内酯A和柴胡中的某些皂苷均具有免疫调节作用，后者还有显著的抗炎作用[23-24]。陈皮提取物可提高免疫器官指数和血清中免疫球蛋白的含量[25]。本试验结果显示，中药组仔猪空肠黏膜中IL-2和SIg A含量在试验第14天均显著高于空白对照组，在第14和21天时中药组空肠黏膜中SIg A的含量均显著高于空白对照组，据此笔者推测，加味二术散对空肠黏膜的免疫力有一定的改善作用；在试验第7和21天，中药组空肠黏膜中的IL-2含量与空白对照组虽然差异不显著，但含量较空白对照组高。有研究显示，有些抗生素具有降低机体免疫力的作用[26]，在本试验中抗生素组的IL-2和SIg A含量显著低于中药组，所以可推断本试验所用抗生素可能也有降低机体免疫力的作用，但仍需进一步的试验证实。

[参考文献]

[1] 吴永魁,胡仲明.动物应激医学及应激的分子调控机制 [J].中国兽医学报,2005,25(5):557-560.

Wu Y K,Hu Z M.Medicine of animal stress and molecular mechanism of stress [J].Chinese Journal of Veterinary Science,2005,25(5):557-560.(in Chinese)

[2] Wathes C M,Miller B G,Bourme F J.Cold stress and post-weaning diarrhoea in piglets inoculated orally or by aerosol [J].Animal Production,1989,49(3):483-496.

[3] 王 为,周国军.细胞因子与炎症性肠病 [J].临床军医杂志,2007,35(3):453-456．

Wang W,Zhou G J.Cytokines and inflammatory bowel disease [J].Clinical Journal of Medical,2007,35(3):453-456.(in Chinese)

[4] 李云海,陈国权.结肠康对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜组织NOS、SOD 及MDA 的影响 [J].中国中医药信息杂志,2001,8(7):36-38．

Li Y H,Chen G Q.Influence of Chinese medicine compound Jiechangkang on the intestine mucosal NOS,SOD and MDA contents in the experimental ulcer colitis rats [J].Journal of Traditional Chinese Medicine,2001,8(7):36-38.(in Chinese)

[5] 王啸春,陈小连,赵珂立,等. 动物肠道氧化应激及抗氧化剂干预作用研究进展 [J].中国畜牧杂志,2011,47(11):73-78.

Wang X C,Chen X L,Zhao K L,et al.Recent advance in oxidative stress in intestinal tract and intervention of antioxidants [J].Chinese Journal of Animal Science,2011,47(11):73-78.(in Chinese)

[6] 李秋红,李廷利,黄莉莉,等.中药抗氧化的作用机理及评价方法研究进展 [J].时珍国医国药,2008,19(5):1257-1258.

Li Q H,Li T L,Huang L L,et al.Research progress on antioxidant activities and evaluation of Chinese medicine [J].Lishizhen Medicine and Materia Medica Research,2008,19(5):1257-1258.(in Chinese)

[7] 向志军,赵广荣,元英进,等.复方丹参的体外抗氧化活性研究 [J].中草药,2006,37(2):211-213.

Xiang Z J,Zhao G R,Yuan Y J,et al.Invitroantioxidant activity of compound Dansen [J].Chinese Traditional and Herbal Drugs,2006,37(2):211-213.(in Chinese)

[8] 林 波,章蕴毅,徐 晗,等.柴胡总多糖对急性肺损伤大鼠的抗氧化作用 [J].中国临床药学杂志,2010,19(1):6-10.

Lin B,Zhang Y Y,Xu H,et al.Anti-oxidative effect of the bupleurum polysaccharides in treating acute lung injury of rats [J].Chinese Journal of Clinical Pharmacy,2010,19(1):6-10.(in Chinese)

[9] 王卫东,赵志鸿.陈皮提取物中黄酮类化合物及抗氧化的研究 [J].食品工业科技,2007,28(9):98-100,103.

Wang W D,Zhao Z H.The extract of flavonoids in and antioxidant research [J].Sience and Technology of Food Industry,2007,28(9):98-100,103.(in Chinese)

[10] 王金梅,张 旭,康文艺.苍术及其麸炒品抗氧化活性研究 [J].精细化工,2010,27(7):664-666.

Wang J M,Zhang X,Kang W Y.Antioxidant activity of atractylodes lancea and atractylodes lancea preparata [J].Fine Chemicals,2010,27(7):664-666.(in Chinese)

[11] Meagher M W,Johnson R R,Young E E,et al.Interleukin-6 as a mechanism for the adverse effects of social stress on acute theiler’s virus infection [J].Brain,Behavior,and Immunity,2007,21(8):1083-1095.

[12] Leanne S S,Ken M C,Lsabelle V,et al.Cytokine and C-reactive protein profiles induced by porcine circovirus type 2 experimental infection in 3-week-old piglets [J].Viral Immunology,2006,19(2):189-195.

[13] Iijima H,Takahashi I,Kiyono H.Mucosal immune network in the gut for the control of infectious diseases [J].Reviews in Medical Virology,2001,11(2):117-133.

[14] Bailey M,Clarke C J,Wilson A D,et al.Depressed potential for interleukin-2 production following early weaning of piglets [J].Veterinary Immunology and Immunopathology,1992,34(3):197-207.

[15] Wattrang E,Wallgren P,Lindberg A,et al.Signs of infections and reduced immune functions at weaning of conventionally reared and specific pathogen free pigs [J].Journal of Veterinary Medicine:Series B,1998,45:7-17.

[16] Kong X F,Wu G Y,Liao Y P,et al.Dietary supplementation with Chinese herbal ultra-fine powder enhances cellular and humoral immunity in early-weaned piglets [J].Livestock Science,2007,108(1):94-98.

[17] 王道福.中药多糖免疫调节作用的研究进展 [J].实用医药杂志,2007,24(2):235-237.

Wang D F.Reasearch progress of polysaccharide immunomodulatory effects [J].Practical Journal of Medicine,2007,24(2):235-237.(in Chinese)

[18] 刘翠艳.兽医中药免疫增强剂的筛选试验及其药理学研究 [D].山东泰安:山东农业大学,2007.

Liu C Y.Screening test and pharmacology study on traditional Chinese medicine immunoenhancer of veterinary field [D].Tai’an,Shandong:Shandong Agricultural University,2007.(in Chinese)

[19] Fang J N,Proksch A,Wagner H.Immunologically active polysaccharides of Acanthopanax senticosus [J].Phytochemistry,1985,24:2619-2622.

[20] Yoshida Y,Wang M Q,Liu J N,et al.Immunomodulating activity of Chinese medicinal herbs and oldenlandia diffusa in particular [J].Immunopharmacol,1997,19:359-370.

[21] Lee J C,Lee K Y,Son Y O,et al.Stimulating effects on mouse splenocytes of glycoproteins from the herbal medicineAtractylodesmacrocephalaKoidz [J].Phytomedicine,2007,14(6):390-395.

[22] Kim S H,Jung H N,Lee K Y,et al.Suppression of Th2-type immune response-mediated allergic diarrhea following oral administration of traditional Korean medicine:Atractylodes macrocephala Koidz [J].Immunopharmacology and immunotoxicology,2005,27(2):331-343.

[23] Wu M H,Tsai W J,Don M J,et al.Tanshinlactone A from Salvia miltiorrhiza modulates interleukin-2 and interferon-γ gene expression [J].Journal of Ethnopharmacology,2007,113(2):210-217.

[24] Navarro P,Giner R M,Recio M C,et al.Invivoanti-inflammatory activity of saponins from Bupleurum rotundifolium [J].Life Sciences,2001,68(10):1199-1206.

[25] 李 玲,陈常秀. 陈皮提取物对肉鸡免疫功能和血清生化指标的影响 [J].黑龙江畜牧兽医,2009,8(15):101-103.

Li L,Chen C X.The effects of citrus extract on immune function and serum biochemical indexes of broiler [J].Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine,2009,8(15):101-103.(in Chinese)

[26] De P P.Immunomodulating effects of antibiotics: literature review [J].Infection,1996,24(4):275-291.