张 磊，周占琴，付明哲，李 广，李思瑶

(1 西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2 华南农业大学 动物科技学院，广东 广州 510642)

硒是一种维持动物正常生长发育不可或缺的营养元素，其在土壤-牧草-饲料-动物链(Soil-Pasture-Feed-Animal Chain，SPFAC)中进行传导[1]，即动物体内的硒元素主要来自摄入的植物中的硒，而植物中的硒元素最终又来源于土壤[2]。但是我国大部分地区处于不同程度的缺硒状态，约有30%以上地区缺硒较为严重[3]，陕西紫阳县是我国仅有的两处富硒地区之一。Ursini等[4]于1982年首次分离纯化得到磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase,PHGPx)，直到1985年才有学者证实其含有硒元素。PHGPx是谷胱甘肽过氧化酶家族重要的含硒酶成员之一，在哺乳动物体内广泛分布[5]，是哺乳动物细胞中惟一能直接还原生物膜上磷脂氢过氧化物的抗氧化酶[6]。PHGPx一方面参与细胞内氧化还原平衡的调控，保护生物膜系统免受氧化损伤[7-8]，另一方面还参与呼吸链的氧化应激从而调控细胞凋亡[9]。有研究表明，缺硒会影响PHGPx基因的翻译以及PHGPx蛋白正常生物学功能的发挥[10-11]，而且PHGPx基因的表达受到多种因素的调节，如动物日粮微量元素水平、日粮蛋白水平、性别、种属和组织差异性等[12-15]。

土壤中的硒含量与植物的硒含量存在明显的正相关关系[16-17]，但是与动物体内硒沉积量的关系目前尚未见报道。另外，目前国内外对PHGPx的研究都聚焦于其在发育过程中的时空表达和补硒对其影响方面[18-20]，且有关硒元素调控PHGPx基因表达的研究结果也不尽一致，而关于生活在自然富硒地区山羊组织中硒含量及其对PHGPx基因在mRNA水平上表达的影响尚未见报道。鉴于此，研究紫阳地区山羊不同组织器官中硒含量的差异及对PHGPx基因表达的影响，对进一步探讨微量元素硒在山羊体内的沉积情况及其对PHGPx基因表达的调控机制具有重要的意义，同时希望本试验结果能够为充分合理利用紫阳县的富硒资源提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

动物组织总RNA提取试剂盒(离心柱型DP431)，购自天根生化科技有限公司；焦碳酸二乙酯(DEPC)，购自Sigma公司；Marker、Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒、SYBR Premix ExTaqTM(RR820A)，均购自TaKaRa公司。荧光定量PCR 8连管(B72711)，购自BIO-plastics公司；CFX96荧光定量PCR仪，购自BIO-RAD公司。

1.2 样品的准备

分别在陕西紫阳县双安镇(试验Ⅰ组)、高滩镇(试验Ⅱ组)以及宝鸡市陈仓区(对照组)各购买7只体质量为45 kg左右的1周岁公山羊，作为试验材料。山羊采取血液后分离血清，然后采用切断颈动脉放血法屠宰，立即采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、股二头肌以及羊毛组织样，每个组织至少采集6份生物学重复样，一半用样袋装好，标记后带回实验室，放入-20 ℃冰箱保存，用于组织硒含量测定；另一半用锡箔纸包好标记后立即投入液氮中，带回实验室，放入-80 ℃冰箱保存，用于mRNA的定量分析。

1.3 血清和组织器官中硒含量的测定及相关性分析

参照GB/T 13883-2008的方法处理样品，分别用超纯水和硒标准液做空白对照和标准参照物对照，采用氢化物发生-原子荧光光谱法[10]测定心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、股二头肌、羊毛和血清样品中的硒含量，然后对血清硒含量与其他组织中的硒含量进行相关性分析。

1.4 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

1.4.1 总RNA的提取和反转录 使用总RNA提取试剂盒提取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、股二头肌组织样品总RNA。采用紫外分光光度计法检测总RNA浓度。用10 g/L琼脂糖凝胶电泳和OD260/OD280的值检测RNA的质量，总RNA于-80 ℃冰箱保存、备用。然后以提取的RNA作为反转录模板，采用Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)试剂盒合成 cDNA，cDNA于-20 ℃保存、备用。

1.4.2 引物的设计与合成 参照GenBank中PHGPx基因(GenBank登录号：NM_174770.3)[21]和内参甘油-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因(GenBank登录号：AF030943)的mRNA序列，利用NCBI Blast 和Primer 5.0软件设计荧光定量PCR跨内含子引物(表1)，引物交由上海生工生物技术有限公司合成。

1.4.3 定量标准曲线的绘制 将各组织cDNA进行2倍稀释(分别为20,2-1,2-2,2-3,2-4,2-5,2-6倍)，进行荧光定量PCR反应，软件自动绘出标准曲线、扩增曲线、溶解曲线和循环阈值。

表1 引物序列信息

1.4.4 qRT-PCR反应PHGPx基因的表达分析采用SYBR Green实时荧光定量PCR方法，反应体系为20 μL：2 μL (100 ng) cDNA，10 μL SYBR Premix ExTaqⅡ(2×)，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，灭菌去离子水6.4 μL。每个样品均重复3次。参照SYBR Premix ExTaqTM (RR820A)说明书,PCR反应程序为：95 ℃预变性45 s；95 ℃变性10 s，64 ℃退火30 s，40个循环；并设置相应的空白对照，PCR结束之后采用溶解曲线来判定引物的特异性。

1.5 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 各组织器官中硒含量的测定结果

由表2可知，山羊心脏、肝脏、脾脏、羊毛以及血清中硒含量在试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和对照组间依次降低，且两两组间差异极显著(P<0.01)。试验Ⅰ组山羊肺脏中硒含量为0.336 5 μg/g，极显著高于试验Ⅱ组(0.128 9 μg/g)和对照组(0.103 6 μg/g)(P<0.01)，而试验Ⅱ组和对照组间差异不显著(P>0.05)。3组山羊均以肾脏硒含量最高，试验Ⅰ组、Ⅱ组和对照组分别达到 0.715 9，0.502 3和0.325 6 μg/g，试验Ⅰ组显著高于对照组(P<0.05)，试验Ⅱ组与其他2组差异均不显著(P>0.05)。试验Ⅰ组背最长肌和股二头肌中的硒含量均极显著高于试验Ⅱ组和对照组(P<0.01)，背最长肌中硒含量分别是试验Ⅱ组、对照组的3.11倍和4.15倍，股二头肌中分别为3.13倍和5.28倍；试验Ⅱ组背最长肌和股二头肌中硒含量分别是对照组的1.34倍和1.69倍(P<0.05)。

对血清硒含量与其他组织中硒含量进行相关性分析，结果(表2)表明，山羊血清中硒含量与其他组织中的硒含量呈正相关关系。虽然相关系数差异均未达到显著水平，但是血清硒含量与心脏、肝脏和脾脏硒含量的相关系数分别达到0.806，0.778和0.864。

表2 山羊各组织中的硒含量及其与血清中硒含量的相关性

2.2 山羊总RNA的完整性检验

从山羊各组织器官中提取的总RNA经10 g/L变性琼脂糖凝胶电泳检测，出现2条清晰的条带(图1)，表明RNA完整。经核酸定量仪检测OD260/OD280的值在1.8～2.1，纯度符合实时荧光定量PCR要求，可以进行反转录。

图1 山羊总RNA样品的电泳检测(部分结果)

2.3 山羊组织中PHGPx基因mRNA的相对表达量

由表3可以看出，试验Ⅰ组山羊PHGPx基因mRNA的表达量由高到低依次为肺脏>股二头肌>脾脏>肾脏>心脏>背最长肌>肝脏。试验Ⅱ组山羊的顺序为肺脏>股二头肌>脾脏>肝脏>肾脏>心脏>背最长肌。对照组山羊的顺序为脾脏>股二头肌>背最长肌>肝脏>肺脏>心脏>肾脏，组织间差异不显著(P>0.05)。

由表3还可以看出，试验Ⅰ组和Ⅱ组间心脏组织PHGPx基因mRNA的表达量差异不显著(P>0.05)，但均显著高于对照组(P<0.05)；Ⅱ组山羊肝脏中PHGPx基因mRNA的相对表达量显著高于Ⅰ组和对照组(P<0.05)，Ⅰ组与对照组差异不显著；3组山羊脾脏、肾脏、背最长肌和股二头肌中PHGPx基因mRNA的相对表达量无显著差异(P>0.05)；Ⅰ和Ⅱ组山羊肺脏PHGPx基因mRNA的相对表达量均极显著高于对照组(P<0.01)，Ⅰ组与Ⅱ组之间差异不显著。

3 讨 论

3.1 山羊组织器官中的硒含量

硒的分布具有明显的区域性，其含量与自然地理条件及土壤类型有关系。陕西省紫阳县是我国继湖北恩施地区之后发现的第二处高硒地区。整个紫阳地区土壤含硒量都比较丰富，但是从西南到东北依次降低，其中双安镇土壤含硒量最高，达到23.63 mg/kg[22]。本试验通过氢化物发生-原子荧光光谱法测定双安镇、高滩镇和宝鸡市陈仓区山羊各组织器官中的硒沉积量，结果显示，山羊体内硒含量从高到低依次为紫阳县双安镇>紫阳县高滩镇>宝鸡市陈仓区，这表明山羊体内的硒沉积量受到当地土壤含硒量的影响。

表3 山羊不同组织中PHGPx基因mRNA的相对表达量

微量元素硒沉积于机体的所有组织器官中，其分布情况因组织器官和摄入量而异[19]。一般说来，动物肾脏和肝脏中含硒量较高，肌肉(心肌硒含量高于骨骼肌)相对较低，脂肪组织最低。Fukuhara等[18]研究表明，在日粮中硒含量保持正常的条件下，机体组织中硒含量分布按肾脏、肝脏、脾脏、心脏、肌肉、脂肪顺序依次递减，与本试验的结果相似。值得指出的是，动物肝脏和肾脏中硒含量对日粮中硒含量的变动十分敏感，而且肝脏和肾脏有贮存过量硒的能力[20]，当体内缺乏硒时，肝脏中贮存的硒元素便会向全身输送以保证其他组织硒的供应。另外本试验发现，紫阳双安镇(试验Ⅰ组)山羊背最长肌中硒含量分别是紫阳高滩镇(试验Ⅱ组)和宝鸡陈仓区(对照组)的3.11倍和4.15倍，股二头肌分别为3.13倍和5.28倍，而且紫阳高滩镇山羊背最长肌和股二头肌中的硒含量分别是宝鸡陈仓区的1.34倍和1.69倍，表明紫阳县的山羊肉中富含微量元素硒，这将为紫阳县发展富硒羊肉的生产提供科学的数据支持。

本研究还发现，山羊血清中硒含量与其他组织中的硒含量呈正相关关系。这提示我们在畜牧生产上，可以在不屠宰羊只的情况下，通过采集、检测血清中的硒含量，推断其他组织中的硒含量。这样不仅可简单方便地了解羊群是否缺硒，以便采取相应的饲养管理措施，而且可以在一定程度上减轻测定山羊体内硒含量的工作量，节省经费。

3.2 PHGPx基因在山羊各组织中的表达以及硒沉积量对其mRNA表达量的影响

有学者以小鼠和人作为研究对象发现，在睾丸组织中PHGPx基因的mRNA表达量极显著高于其他组织器官[23-26]。本试验通过实时荧光定量PCR技术分别检测了紫阳地区和宝鸡地区山羊心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、股二头肌组织中PHGPx基因mRNA的相对表达量，结果表明PHGPx基因在山羊的上述组织中均有表达。但是目前PHGPx基因在动物各组织器官中差异性表达的研究尚未得到统一的结论。张建新等[21]报道，PHGPx基因mRNA在太行青山羊组织器官中的表达量由高到低依次为：心脏>肺脏>肾脏>肝脏>脾脏>肌肉;而Baek等[27]以小鼠为研究对象发现，其PHGPx基因mRNA由高到低依次为心脏>肝脏>小肠>肾脏>肺脏；但是陈伟等[20]报道，PHGPx基因mRNA在莱芜猪中的表达规律为：脑、心、肝、脾>肌肉>脊髓、大肠、背膘、小肠>肺；这些研究结果均与本试验结果不完全一致。推测其可能的原因有：一是物种的差异；二是PHGPx基因在动物体内的表达具有时间和空间的差异性，并且受到很多生理和病理因素的影响；三是本研究的试验对象来自硒含量不同的地区，硒含量的差异影响了山羊各组织器官中PHGPx基因表达的差异性。

大量研究表明，在哺乳动物细胞中调控蛋白生成的关键步骤主要发生在转录水平上[28]。动物PHGPx基因的表达受很多因素的影响，如某些微量元素水平、组织差异和生长阶段等[15,29]，微量元素硒是重要调控因素之一[30]。本试验结果表明，对照组山羊各组织器官中PHGPx基因mRNA的表达量均低于试验 Ⅰ 和 Ⅱ 组，且不同硒含量对PHGPx基因表达的调控有差异。肺脏中沉积的硒上调了PHGPx基因的表达，但背最长肌和股二头肌中沉积的硒对PHGPx基因表达无显著影响。这可能是因为肺脏、肾脏中PHGPx基因mRNA的表达对硒的依赖性较肌肉组织大，对硒含量的变化较敏感。

目前，关于微量元素硒对PHGPx基因表达调节的研究尚未得到统一的结论，Bermano等[31]的研究认为，缺硒并不会影响大鼠心脏和肝脏组织中PHGPx基因mRNA的表达量；但是Pagmantidis等[32]发现，缺硒会显著降低大鼠结肠黏膜细胞中PHGPx基因mRNA的表达水平(P<0.05)；郑良焰等[15]以不同硒含量的日粮饲喂小鼠，结果发现日粮中硒含量为0.1 mg/kg时，小鼠肝脏中PHGPx基因mRNA的相对表达量最高，显著高于0.045和0.4 mg/kg组(P<0.05)，与本试验的结果相一致，这预示着适量摄入硒会在转录水平上上调肝脏中PHGPx基因的表达。有研究认为，硒元素不影响PHGPx基因mRNA的转录速率，而是在转录后水平通过影响mRNA稳定性来调节mRNA的水平[33]，这有待于进一步研究。

4 结 论

陕西紫阳县山羊各组织中硒含量均高于宝鸡地区山羊，羊肉中也富含硒元素，表明土壤硒含量会影响山羊体内硒的沉积量。血清中硒含量与其他组织中的硒含量呈正相关关系，可以通过测定血清中的硒含量来推断山羊其他组织器官中的硒含量。山羊的心脏、肝脏、肺脏组织中沉积的硒元素显著影响了其PHGPx基因mRNA的表达量，表明微量元素硒可在转录水平上调控PHGPx基因的表达，但这种调控具有组织差异性。

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