马骁骁　杨侃　晁天柱　薛慧慧　邓倩云　常雪莹　周宇荀

摘要：目的：构建携带增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein， EGFP）和miR-505基因的慢病毒载体。方法：采用PCR方法从pcDNATM6.2-GW/ EmGFP-miR-505表达载体质粒扩增出miR-505 shRNA基因编码区173bp、175、171bp片段，通过限制性酶切、T4DNA连接酶连接，分别将miR-505 shRNA基因插入慢病毒表达载体FUGW与L26Fsy（1.1）GW中，构建成重组载体FUGW-miR-505-3p/5p/nc与Fsy-miR-505-3p/5p/nc。脂质体介导下将慢病毒重组载体转染至HEK 293T细胞，通过EGFP观察转染效率，RT-PCR方法检测miR-505的表达量。结果：荧光显微镜下观测到HEK 293T细胞转染后有较强绿色荧光；RT-PCR显示转染FUGW-miR-505-3p/5p与Fsy-miR-505-3p/5p的HEK 293T细胞中对应miR-505-3p/5p明显升高。结论：成功构建带有EGFP和miR-505-3p/5p/nc shRNA基因的慢病毒表达载体。

关键词：miR-505；慢病毒载体；HEK293T细胞；瞬时转染；RT-PCR

中图分类号：R34 文献标识码： A 文章编号： 1674-0432（2014）-04-24-3

miRNA（MicroRNA）是近年来备受关注的一类内源性非编码小分子RNA，长度为21～25个核苷酸，由具有发夹结构约70～90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，通过与其目标mRNA分子的3端非编码区域（3'UTR）互补配对使其目标mRNA分子的翻译受到抑制[1～3]。自从1993年第一个miRNA被报道以来，人们发现miRNAs几乎参与了所有重要的生物学过程的调控[4]，miRNAs的异常表达与人类多种疾病相关[5]。迄今为止，700多种已被鉴定出来的人源性miRNAs调控了人类1/3以上基因的表达。

慢病毒为一类逆转录病毒的总称，与其他逆转录病毒载体相比，慢病毒载体主要有以下几个优点：其一，慢病毒载体既可以转染处于有丝分裂活跃期的细胞，又可以转染分裂缓慢及处于分裂终末期的细胞[6]；其二，由慢病毒载体携带整合入宿主基因组的目的基因对转录沉默作用有较强的抵抗能力，在体外培养细胞实验和体内移植实验中，由慢病毒载体携带导入的目的基因可以在宿主细胞中得到长期而稳定的表达；其三，慢病毒载体可以兼容多个转录启动子，包括细胞特异性启动子和在基因组中普遍存在的管家基因的启动子；其四，经过改建后的慢病毒载体可以容纳约10kb左右的外源基因，因此大多数的cDNA都能被克隆入慢病毒载体。慢病毒载体的上述优点使其成为体内和体外基因转移的一种有效工具，目前慢病毒也被广泛地应用于表达microRNA的研究中[7]。

泛素启动子UBC为人和小鼠细胞的组成型启动子，包含多种转录因子，且具有泛素系统本身的特性，与常用的病毒启动子相比，其细胞来源的特性以及组成型表达的特点可能使它们更加适合驱动外源基因在哺乳动物细胞中的高效表达[8]。另外，大鼠SynaptinI （突触蛋白I）启动子（FsyI）是在神经元中特异表达的启动子。

为提高本研究所用miR-505在中枢神经系统中表达的特异性，选用UBC作为启动子的慢病毒载体FUGW与大鼠SynaptinI 的慢病毒载体L26Fsy（1.1）GW，构建能高效表达miR-505的慢病毒载体，旨在为进一步的研究打好基础。

1 材料与方法

1.1 材料

pcDNATM6.2-GW/ EmGFP-miR-505-3p/5p过表达质粒，ASF/SF2过表达载体（上海invitrogen公司）；载体质粒FUGW、L26Fsy（1.1）GW由中科院上海神经所惠赠；PCR引物、测序（上海生工）；EcoRI酶、BamHI等核酸内切酶、klenow大片段、去磷酸化酶、T4 DNA连接酶（大连宝生物工程有限公司）；大肠杆菌感受态细胞DH5α（上海天根化工有限公司）；无内毒素小量质粒抽提试剂盒、中量质粒抽提试剂盒（上海生工）；逆转录试剂盒（MBI Fermentas 公司，美国）；阳离子脂质体lipofectamineTM2000（上海invitrogen公司）；HEK293T细胞（本实验室保存）；DMEM高糖培养基、opti-MEM培养基、FBS（Hyclone，美国），PBS、胰酶（上海宁盛生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 miR-505慢病毒载体的构建及鉴定

首先利用以下一对引物：

PcDNA-left：5'CCGGAATTCAGTGGATCCTGGAGGCTTG

EcoRI BamHI

PcDNA-right：5'CCGGAATTCCAGATCTGGGCCATTTGTTC

EcoRI BglII

采用PCR方法将带有侧翼的miR-505-3p/5p/nc的shRNA基因从pcDNATM6.2-GW/ EmGFP-miR-505载体质粒（以下简称pcDNA-miR-505）扩增得到分别包含miR-505-3p，miR-505-5p及miR-505-nc（有相似结构但无关序列的对照组）的shRNA基因。1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，纯化回收，EcoRI酶切，再次纯化。

EcoRI酶切FUGW和L26Fsy（1.1）GW（以下简称Fsy）空载体成线性化，分别与miR-505 shRNA基因片段4oC过夜连接，转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，经菌落PCR筛选出插入目的基因的重组质粒，试剂盒法提取质粒，鉴于FUGW、Fsy空载体序列含有单一BamHI酶切位点，miR-505目的基因片段在5'端也含有一个BamHI酶切位点，进行BamHI酶切检测目的基因插入的方向和拷贝数，测序确认后，得到表达载体。将连接正确的重组载体命名为FUGW-miR-505-3p、FUGW-miR-505-3p、FUGW-miR-505-nc（简称FUGW-miR-505-3p/5p/nc），Fsy-miR-505-3p、Fsy-miR-505-3p、Fsy-miR-505-nc（简称Fsy-miR-505-3p/5p/nc）。

1.2.2 细胞培养与转染

1.2.2.1细胞传代培养 HEK293T细胞培养于含有10%的FBS和1%的青链霉素的DMEM高糖培养基中，置于培养箱中37℃，5% CO2，取对数生长期细胞进行转染试验。

1.2.2.2脂质体法转染 采用脂质体法将pcDNA-miR-505-3p/5p/nc与构建成功的重组载体FUGW-miR-505-3p/5p/nc，Fsy-miR-505-3p/5p/nc分别转染至HEK293T细胞。

实验前将HEK293T细胞以5×105/孔密度接种于12孔板。转染前2小时将DMEM高糖培养基换成opti-MEM培养基，待转染的细胞为单层并处于对数中期，融合度选择为70%～80%时进行转染。12孔板各孔转染用质粒与脂质体Lipofectamine2000分别为2微克和4微升，转染步骤按脂质体Lipofectamine2000转染试剂说明书操作。转染后6小时更换成含有4%青链霉素的正常DMEM高糖培养基。转染后细胞置培养箱37℃，5%CO2孵育48小时。48小时，Trizol法提取12孔板细胞的总mRNA。

1.2.3 RT-PCR法检测miR-505-3p/5p含量 采用Trizol法抽提的总mRNA，具体操作按照说明书进行，以总RNA为模板，以下列特异引物进行逆转录反应，得到各目的基因的cDNA。

逆转录引物：miR-505-3p：5'GCGTCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACGCAGAAAACCA

GC，

miR-505-5p：5'GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT

ATTCGCACTGGATACGACAACATCAATA，

m16基因：5'GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT

TCGCACTGGATACGACCGCCAA

逆转录步骤按试剂盒说明书操作。制备的cDNA稀释5倍作为模板，进行实时荧光定量PCR反应，miR-505-3p基因上游引物：GCGAGCACCGTCAACACT，下游引物：TGGTGTCGTGGAGTCGGC，

miR505-5p基因上游引物：GCCCGGGAGCCAGGAAG，下游引物：CAGGGTCCGAGGTATTCGCAC，

m16基因上游引物：CGCGCTAGCAGCACGTAAAT，下游引物：GTGCAGGGTCCGAGGT。95oC变性2s，62℃退火延伸32s，共反应40个循环，分析溶解曲线。 △Ct=Ct（miR-505-3p/5p/nc）-Ct（m16），△△Ct=△Ct（miR-505-3p/5p）-△Ct（miR-505-nc）表示miR-505-3p/5p的表达，2-△△Ct表示实验组与对照组miR-505表达量差异。

1.3 统计方法

实验数据均以均值+标准差表示，依SPSS10.0统计学软件进行t检验，P<0.05表示差异具有显著性。

2 结果

2.1 miR-505慢病毒重组载体的鉴定

PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳示分别在173bp、175bp、171bp左右有特异扩增条带，与预期相符，产物单一，说明引物特异性较好（图1）。

菌落PCR产物1%的琼脂糖凝胶电泳出现3种特异性条带，分别于：208bp、416bp、624bp左右（图2），说明目的小片段插入载体上的拷贝数不同，分别为1、2、3。

根据载体与目的片段上BamHI酶位点位置，BamHI酶切可以鉴定插入片段的方向。琼脂糖凝胶电泳结果示，对于插入一个拷贝的重组载体来说，770bp左右处出现特异性条带为正向插入，反之913bp处出现特异性条带为反向插入。而对于插入两拷贝的重组载体也显示出两种情况：770bp、161bp处同时出现条带，913bp与161bp处同时出现条带，前者为两拷贝都正向插入，后者则为两拷贝都反向插入（图3）。

选取正向插入的重组载体进行测序，结果与GenBank中提供的序列一致，证明载体构建成功（图4）。

以FUGW-miR-505-3p为例，构建成功的载体图谱如图5。

2.2 miR-505对HEK293T细胞的转染

质粒转染HEK 293T细胞后48小时，于荧光显微镜下观察发现，三组质粒转染的细胞中都有EGFP绿色荧光表达有差异，组内绿色荧光表达相差不大。其中FUGW组表达荧光强度最高，pcDNA组次之，Fsy组最弱，（图6）。

2.3 RT-PCR检测细胞中miR-505表达水平

抽提总RNA，RT-PCR结果显示：转染48小时时，转染质粒pcDNA-miR-505-3p、FUGW-miR-505-3p与Fsy-miR-505-3p的细胞中miR-505-3p明显增高，miR-505-5p几乎无变化（图7A，p<0.05）。转染质粒pcDNA-miR-505-5p、FUGW-miR-505-5p与Fsy-miR-505-5p的细胞中miR-505-5p也明显增高，miR-505-3p几乎无变化（图7B，p<0.05），说明构建的表达载体能实现microRNA的过表达。

3 讨论

miR-505位于小鼠X染色体X：57647578-57647667处，ATP11C基因的第一和第二个外显子之间的第一个内含子中，对于其生物学功能的研究目前还处于起步阶段。2010年，Verduci L等发现miR-505能通过作用于其靶标ASF/SF2（可变剪接因子）发挥调控小鼠胚胎成纤维细胞的增殖和衰老/凋亡的作用[9]。Karni R等发现在许多细胞中转染ASF/SF2可以激活mTOR部分信号通路[10]。Yamamoto Y等在研究肿瘤多药抗性时，发现miR-505是一个新的肿瘤抑制miRNA，与其呈现负相关的蛋白Akt3，与mTOR通路上的AKT属于同一基因家族[11]。因此miR-505极有可能通过调控mTOR信号通路发挥其生物学功能，而mTOR通路是目前分子生物学研究的热点，它能整合细胞内和细胞间的信号，起到调控细胞代谢，生长，增殖和存活等过程的中心调控者的作用，mTOR通路的改变与多种疾病相关[12]。

在细胞水平对小RNA进行研究，可采用合成的双链siRNA或者构建在表达载体上的shRNA转染细胞进行。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制[13]。

采用事先在体外构建能够表达shRNA的载体， 然后转移到细胞内转录shRNA，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用[14]。

本实验成功将miR-505的基因片段克隆到具有神经元特异性的慢病度真核表达载体中，并通过瞬时转染的方法转染HEK293T细胞，荧光显微镜下观察转染构建的慢病毒载体在HEK293T细胞中EGFP荧光表达，实时定量PCR结果也表明HEK293T细胞中能高表达miR-505，证明构建载体成功。总之，我们将利用构建成功的慢病毒表达载体对miR-505的功能进行更加深入的研究，对miR-505调控的靶基因以及其他小分子RNA之间是否存在功能上的关联进行深入研究，以期进一步阐明miR-505的功能。

参考文献

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[2] Brennecke J，Stark A，Russell R B，et al.Principles of microRNA-target recognition[J].PLoS Biol，2005，3（3）：e85-e85.

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[11] Yamamoto Y，Yoshioka Y，Minoura K，Takahashi R，Takeshita F et al.An integrative genomic analysis revealed the relevance of microRNA and gene expression for drug-resistance in human breast cancer cells[J].Mol Cancer，2011，10（135）：39551-39563.

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[13] Kim VN. RNA interference in functional genomics and medicine[J].J Korean Med Sci， 2003，18（3）：309-318.

[14] SuiG，Soohoo C，Affarel B，et al.RNA interference in functional genomics and medicine [J].Proc Natl A cad Sci USA，2002，99（8）：5515-5520.

作者简介：马骁骁，东华大学生物科学与技术研究所，硕士研究生，研究方向：分子遗传学；周宇荀，东华大学生物科学与技术研究所，副教授，研究方向：医学分子遗传学。

网络出版时间：2014-3-11 10：20：32

网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/22.1186.S.20140311.1020.002.html

在细胞水平对小RNA进行研究，可采用合成的双链siRNA或者构建在表达载体上的shRNA转染细胞进行。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制[13]。

采用事先在体外构建能够表达shRNA的载体， 然后转移到细胞内转录shRNA，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用[14]。

本实验成功将miR-505的基因片段克隆到具有神经元特异性的慢病度真核表达载体中，并通过瞬时转染的方法转染HEK293T细胞，荧光显微镜下观察转染构建的慢病毒载体在HEK293T细胞中EGFP荧光表达，实时定量PCR结果也表明HEK293T细胞中能高表达miR-505，证明构建载体成功。总之，我们将利用构建成功的慢病毒表达载体对miR-505的功能进行更加深入的研究，对miR-505调控的靶基因以及其他小分子RNA之间是否存在功能上的关联进行深入研究，以期进一步阐明miR-505的功能。

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[14] SuiG，Soohoo C，Affarel B，et al.RNA interference in functional genomics and medicine [J].Proc Natl A cad Sci USA，2002，99（8）：5515-5520.

作者简介：马骁骁，东华大学生物科学与技术研究所，硕士研究生，研究方向：分子遗传学；周宇荀，东华大学生物科学与技术研究所，副教授，研究方向：医学分子遗传学。

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在细胞水平对小RNA进行研究，可采用合成的双链siRNA或者构建在表达载体上的shRNA转染细胞进行。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制[13]。

采用事先在体外构建能够表达shRNA的载体， 然后转移到细胞内转录shRNA，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用[14]。

本实验成功将miR-505的基因片段克隆到具有神经元特异性的慢病度真核表达载体中，并通过瞬时转染的方法转染HEK293T细胞，荧光显微镜下观察转染构建的慢病毒载体在HEK293T细胞中EGFP荧光表达，实时定量PCR结果也表明HEK293T细胞中能高表达miR-505，证明构建载体成功。总之，我们将利用构建成功的慢病毒表达载体对miR-505的功能进行更加深入的研究，对miR-505调控的靶基因以及其他小分子RNA之间是否存在功能上的关联进行深入研究，以期进一步阐明miR-505的功能。

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[10] Karni R，Hippo Y，Lowe SW，Krainer AR.The splicing-factor oncoprotein SF2/ASF activates mTORC1.[J].Proc Natl Acad Sci USA.，2008，105（40）：15323-15327.

[11] Yamamoto Y，Yoshioka Y，Minoura K，Takahashi R，Takeshita F et al.An integrative genomic analysis revealed the relevance of microRNA and gene expression for drug-resistance in human breast cancer cells[J].Mol Cancer，2011，10（135）：39551-39563.

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作者简介：马骁骁，东华大学生物科学与技术研究所，硕士研究生，研究方向：分子遗传学；周宇荀，东华大学生物科学与技术研究所，副教授，研究方向：医学分子遗传学。

网络出版时间：2014-3-11 10：20：32

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