孙叶迎，陈丽飞，刘树英，刘 昕，曹 岩，刘洪章

(吉林农业大学 a 生命科学学院，b 园艺学院，吉林 长春 130118)

杓兰属(Cypripedium)是兰科的一个属，多年生草本植物[1]。杓兰属植物最显著的特征是其花唇瓣特化成兜状，因此，有人称之为“大口袋花”。杓兰属植物低垂的花瓣酷似拖鞋，生活在终年云雾缭绕、遍地野花的高山上，也被称为“仙女的拖鞋”，西方人美其名曰“lady’s slipper”，即拖鞋兰[2]。此属植物花形奇特，颜色艳丽，株型优雅多姿，观赏价值极高，深受园艺学家们的喜爱，并将收集杓兰属植物作为目标[3]。杓兰属的地理分布式样较杓兰亚科中其他4个属复杂[1,4]。50余种杓兰属植物广泛分布在北半球温带和亚热带山地，东亚和北美为主要的分布中心[1,5]。我国杓兰属植物种类繁多，资源丰富，被称作杓兰资源多样性中心[6-7]。据《中国植物志》记载，中国有杓兰属植物32种及1个变种，近年来报道或正式命名的新品种有4个[8-11]，共36种，1个变种，其中21种及1变种是我国的特有种。据《东北植物检索表》记载，东北地区分布的杓兰属植物有大花杓兰、斑花杓兰、杓兰和黄铃杓兰4个种及大白花杓兰1个变型[12]。长白山地区除了上述杓兰属植物外还有东北杓兰、山西杓兰，但在长白山地区，甚至东北地区均未见黄铃杓兰的模式标本植物[13]。目前，杓兰属植物由于遭破坏性采挖加之其繁育困难，造成其种群数量下降，已处于严重濒危状态[14]，被列入《野生动植物濒危物种国际贸易公约》的保护范围[1,15-16]。种群内遗传多样性的丢失会导致物种对环境变化的适应性降低，增加了灭绝的危险，所以，对于幸存的濒危物种而言，研究其遗传多样性，对濒危物种的管理保护及遗传多样性的评定至关重要[3,17-18]。

ISSR(Inter simple sequence repeats)又称简单重复序列区间，是由Zietkiewicz等[19]创建的新型分子标记技术。它是在SSR分子标记的基础上建立起来的，与SSR分子标记相比无需知道DNA序列的信息；重复性好，克服了RAPD分子标记不稳定的缺点。在真核生物中，微卫星DNA分布广泛，且变异速度快，利用ISSR引物对微卫星DNA序列进行扩增，能够快速检测出差异位点，因此ISSR标记在植物遗传育种研究中得到广泛应用。但在杓兰属植物的研究中尚未见报道。

本试验采用ISSR分子标记技术对长白山区不同花色的杓兰属植物进行研究探讨，对其遗传多样性以及亲缘关系进行分析，全面掌握长白山区现有杓兰属种质资源的遗传多样性，减少育种工作中亲本选择的盲目性，提高育种效率，以期更好地对濒危物种进行保护。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料采自于长白山区，分别为大花杓兰(CypripediummacranthumSw.)、东北杓兰(Cypripedium×ventricosumSw.)、杓兰(CypripediumcalceolusL.)、山西杓兰(CypripediumshanxienseS.C.Chen)4个种，以萼片颜色区分，共8个颜色11个个体，具体如表1所示。于2012-06采集各种植物新鲜叶片置于冰盒中带回，于-80 ℃低温冰箱保存。

表 1 供试杓兰属植物材料的概况

1.2 方 法

1.2.1 基因组DNA提取及质量检测 采用CTAB法[20-21]提取4种植物11个个体的基因组DNA，并用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA质量，凝胶成像系统(UVP GelDoc-ItTM型)照相，保存。再用Bi-PHotomete(EPpendor公司)核酸检测仪测定OD260/OD280及OD260/OD230，检测DNA样品的纯度与浓度。

1.2.2 ISSR-PCR扩增与电泳 试验用哥伦比亚大学报道的植物通用的ISSR引物和相关文献报道的引物[22-23]，均由北京三博远志生物技术有限责任公司合成，共37个。从中筛选扩增条带清晰、多态性高、重现性好的引物，参考不同引物的退火温度，采用梯度PCR确定每个引物的退火温度。扩增反应在PCR(德国Eppendorf Mastercycler personal)扩增仪上进行。ISSR反应体系25 μL：1.5 μL DNA模板(20 ng/μL)，1.5 μL 引物(10 μmol/L)，2 μL dNTP (2.5 mmol/L，宝生物工程 (大连) 有限公司)，2.5 μL 10×PCR buffer，0.15 μLTaqDNA聚合酶(5 U/μL，宝生物工程 (大连) 有限公司)；17.35 μL ddH2O。PCR扩增程序：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性1 min；55～57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃ 15 min终止反应。所得产物用60 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳(1×TBE)检测，560 V电压电泳1 h，再用体积分数10%醋酸溶液固定30 min，银染10 min，强碱显影直至条带清晰，照相，观察扩增结果。所有试验均重复2次。

1.3 数据统计与分析

用聚丙烯酰胺凝胶对扩增产物进行分离后，对电泳图进行人工读带。其中每条带视为1个分子标记[21]，即1个引物的结合位点，以250 bp DNA ladder 为标准，对重复性好的条带进行统计，无论强弱有则记为1，无则记为0，模糊不清的条带也记为0。将数据输入数据矩阵，使用NTSYS-pc软件对不同花色杓兰属植物之间的相似系数进行分析，采用UPGMA法分析样品间的遗传关系，进行聚类分析。用Popgene32软件[24]分析观测的等位基因数(na)、有效等位基因数(ne)、Nei’s基因多样性(He)、Shannon信息指数(Ho)和遗传距离。

2 结果与分析

2.1 ISSR-PCR引物筛选及扩增

随机选取3份供试材料作为模板进行扩增，结果显示，在37个引物中筛选出14个条带清晰、具有差异的引物；再用这14个引物分别对11份材料进行复筛，最终确定扩增效果较好的11个引物(表2)。引物UBC835对11个个体的DNA扩增结果见图1。经统计11个引物共扩增出94条条带，平均每个引物获得8.5条条带，其中多态性条带为86条，多态基因位点比例为 91.5%(表2)。

表 2 对11份杓兰属植物材料扩增效果好的ISSR引物序列及多态性分析

图 1 引物UBC835对11份杓兰属植物材料的ISSR-PCR扩增结果

2.2 杓兰属植物的ISSR特异性标记

图2、3分别为引物UBC844、UBC856对11分杓兰属植物材料基因组DNA的扩增结果。本研究中，11条引物共产生了9条特异性条带，具有特异性条带的植物样品见表3。由表3可以看出，深粉色大花杓兰B3和栗色的杓兰B7特异性标记最多，各有3条；紫红色杓兰B5、粉红色大花杓兰B6、紫红色东北杓兰B10各有1条特异性条带。

图 2 引物UBC844对11份杓兰属植物材料的ISSR-PCR扩增结果

图 3 引物UBC856对11份杓兰属植物材料的ISSR-PCR扩增结果

表 3 杓兰属植物的ISSR特异性标记样品

2.3 杓兰属植物的遗传多样性

表4显示，11份材料的平均有效等位基因数为1.418 2，平均Nei’s基因多样性为0.250 0，平均Shannon信息指数为0.369 7。其中Nei’s基因多样性最大值为0.500 0，最小值为0.000 0；Shannon信息指数最大值为0.693 1，最小值为0.000 0，可见，各位点遗传多样性程度存在较大差别。

表 4 不同花色杓兰属植物材料的遗传多样性

续表 4 Continued table 4

2.4 杓兰属植物的遗传距离和相似系数

11份材料的遗传距离和遗传相似系数见表5。表5显示，样本间的遗传距离为0.010 5～0.969 7，其中B4大花杓兰(浅粉红色)与B6东北杓兰(粉白色)之间的遗传距离最小，为0.010 5；B4大花杓兰(浅粉红色)与B5杓兰(紫红色)及B9山西杓兰(褐色)与B10东北杓兰(紫红色)的遗传距离均最大，为0.969 7。

表 5 不同花色杓兰属遗植物的遗传距离(对角线以下)和相似系数(对角线以上)

2.5 杓兰属植物的聚类分析

图5为8个不同花色11个杓兰属植物个体的ISSR聚类图。在相似系数为0.62时，将11个材料分为2类，4种颜色的大花杓兰分为一类，另一类为2种花色的杓兰、东北杓兰、山西杓兰以及紫红色杓兰变型。相似系数为0.66时，将第1类中的粉红色大花杓兰单分为一组；第2类中分为2组：2种花色的杓兰与2种花色的东北杓兰分为一组，2种花色山西杓兰与杓兰变型分为一组。

图 4 11个杓兰属植物的聚类分析结果

3 讨 论

3.1 杓兰属植物的遗传多样性

本研究结果表明，长白山区杓兰属植物的多态基因位点比例为91.5%，平均Nei’s基因多样性(He)为0.250 0，平均Shannon信息指数(Ho)为0.369 7，表现出较高的遗传多样性。Takeshi等[3]对日本礼文岛濒危大花杓兰的遗传多样性研究结果表明，礼文岛的大花杓兰具有较高的遗传多样性，多态基因位点比例为62%，观测的等位基因数为1.85，有效等位基因数为1.28，Nei’s基因多样性为0.187，Shannon信息指数为0.163，较长白山区杓兰属植物遗传多样性低；Brzosko等[25]研究表明，C.calceolus的遗传多样性(多态基因位点比例为46%，观测的等位基因数为1.73，Nei’s基因多样性为0.156，Shannon信息指数为0.184)也比长白山区杓兰属植物低。而蔡凝枫等[26]采用RAPD标记对云南中甸黄花杓兰的遗传多样性进行研究，发现其多态基因位点比例为82.69%，Nei’s基因多样性为0.288 4，Shannon信息指数为0.431 2；Michael等[27]发现,欧洲西北部杓兰的多态基因位点比例为82.5%，观测的等位基因数为1.278，Nei’s基因多样性为0.40～0.53。可见以上地区杓兰属植物均较长白山区杓兰属植物的遗传多样性高。推断野生杓兰属资源遭到破坏的主要原因是人类的滥采滥挖，对其进行保护可从以下2点入手： 1)建立自然保护区，加强对其生境的保护，禁止滥采滥挖，尤其是商业性质的采集；2)生境破坏严重的地区可以进行迁地保护。

3.2 杓兰属植物的聚类分析

杓兰属植物隶属于兰科杓兰属，与其他兰科植物一样，都是单子叶植物，杂交范围宽，种间甚至属间都能杂交。兰科植物多适应虫媒传粉，花部特征都表现出高度适应和特化，在自然杂交中变异性大，种间种类很多，种的界限不清楚，一般多依照形态学分类。本研究采用ISSR分子标记方法，对长白山区8种不同花色11个杓兰属植物个体进行了分类，结果显示，分子标记的分类结果与形态学的分类结果存在一定程度的一致性，大白花杓兰B2是大花杓兰的一个变型，其花唇瓣与萼片颜色都为纯白色。由聚类结果可知，大白花杓兰与浅粉红色的大花杓兰B1关系更近，在聚类图上处于同一分支，这与形态学分类结果一致；而东北杓兰是杓兰与大花杓兰的天然杂交种，花型在形态上更接近于大花杓兰，但却与杓兰聚为一类，由此可见，东北杓兰与杓兰的关系更为密切。杓兰变型(B8)植物中，其每株植株上具有2朵花，萼片颜色为紫红色，花唇瓣颜色为黄色，具有褐色斑点，颜色与杓兰相似；此外，其上面花朵的下萼片浅裂，下面花朵的下萼片深裂，与山西杓兰相似，可见B8是介于杓兰与山西杓兰之间的一个变型，但在有关的文献中并无记载，是一个新类型，本研究将其暂定为杓兰变型，聚类结果显示其与山西杓兰聚为一类，可见其与山西杓兰的亲缘关系更近一些，是山西杓兰的一个变型。

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