胡运高，杨国涛，唐力琼，张 玲，马 坤，郭连安

(西南科技大学 水稻研究所，四川 绵阳 621010)

稻瘟病是水稻三大病害之一，对水稻生产造成严重威胁。研究表明，将稻瘟病菌毒素稀释液滴在水稻叶片机械伤口，会产生与病原菌一样的病斑[1]，因此稻瘟病对水稻的危害，实质是其致病真菌稻瘟菌产生的毒性物质对水稻造成的迫害。稻瘟病菌毒素主要包括α-吡啶羧酸、稻瘟菌素、稻瘟醇、细交链孢菌酮酸、糖肽类物质、香豆素等。前人通过喷雾、注射和浸根等方法研究稻瘟病菌毒素对水稻生理的影响，发现它能抑制种子萌发、幼苗生长、愈伤组织生长，破坏水稻细胞及其超微结构，诱导水稻防御性酶活性等[2-4]。

叶绿素荧光参数(Chlorophyll fluorescence parameters)可反映植物光合机构内部一系列重要的调节过程，以及光合作用的能量转换轨迹，因而成为原位检测PSⅡ能量转换与传递的极好探针[5]。目前，对植物叶绿素荧光参数的研究多集中在重金属[6]、干旱[7]、低温[8]等胁迫引起的逆境生理方面，有关病原菌和病原菌毒素对植物光系统影响的研究也有少量报道，如高粱靶斑病菌侵染能显著抑制高粱最大光能转化效率(Fv/Fm)和实际光能转化效率(ΦPSⅡ)[9]；番茄黄化曲叶病毒侵染能显著降低番茄叶片ΦPSⅡ、非循环光合电子流速率(ETR)、光化学淬灭系数(qP)，而非光化学淬灭系数(qN)显著升高[10]；条锈病能明显抑制小麦Fv/Fm和潜在光化学活性(Fv/Fo)[11]；姜述君等[12]研究发现，马唐生防菌画眉草弯孢霉毒素能导致马唐离体叶片Fv/Fo、Fv/Fm、ΦPSⅡ、qP显著降低，而初始荧光(Fo)显著升高；刘玉晓等[13]研究表明，链格孢菌毒素能阻断莱茵藻受体侧 QA 到 QB 的电子传递，使反应中心失活，降低光能转化效率。但目前，有关稻瘟病菌毒素对水稻光系统影响的研究尚未见报道。本试验研究了ZA10、ZA14、ZA18、ZC11 4个稻瘟病菌生理小种粗毒素对各生育期水稻叶绿素荧光参数的影响，以期为水稻抗稻瘟病机制研究提供理论依据，为稻瘟病的适时防治提供重要指导。

1 材料与方法

1.1 材 料

杂交水稻品种冈优725，稻瘟病菌生理小种ZA10、ZA14、ZA18、ZC11(这4个生理小种均从冈优725感病植株上分离获得，其对冈优725致病能力最强)，均由西南科技大学水稻研究所提供。

供试土样养分含量：全氮 1.98 g/kg，速效氮 80.3 mg/kg，速效磷 43.3 mg/kg，速效钾 76.2 mg/kg。

1.2 方 法

1.2.1 稻瘟病菌毒素的制备 将4个稻瘟病菌生理小种菌株(2块，直径5 mm)分别接种到100 mL山口富夫培养液中，于28 ℃、120 r/min下振荡培养15 d后，将菌丝球捣碎后与原培养液混合，28 ℃静置培养30 min，定性滤纸过滤2次，即得到稻瘟病菌粗毒素原液，用无菌水将稻瘟病菌粗毒素原液稀释1倍即得到50%毒液。

1.2.2 水稻幼苗的移栽及毒素处理 盆栽试验于2011-03-10在西南科技大学生命科学与工程学院盆栽场内进行。用26.5 cm×38.6 cm的塑料钵装 7.5 kg风干土，用自来水浸泡5 d，且每盆施1 g复合肥作为底肥，保持土面水深3 cm。在适龄移栽期，取生长健壮秧苗移栽至塑料钵中，每盆3株。试验采用随机区组设计，待水稻幼苗返青后，除去盆中表面积水，分别用4个稻瘟病菌生理小种粗毒素原液及其50%浓度毒液1 L浇灌盆钵中水稻幼苗，每处理5盆，并以无菌空白培养液为对照。处理3 d后，追施1次尿素。待分蘖达到7～10个时，晒田控苗。

1.2.3 指标测定 按照水稻生育进程，分别于分蘖盛期、拔节期、孕穗期、齐穗期和成熟期测定水稻叶绿素荧光参数。测定部位为水稻主茎最上部完全展开叶中部，每处理5次重复，每重复测定3片叶，取平均值。在每个生育时期选择一个晴天，用Dual PAM 100叶绿素荧光仪(德国Walz)测定荧光参数，包括： PSⅡ的最大光能转化效率(Fv/Fm)、潜在光化学活性(Fv/Fo)、初始荧光(Fo)、实际光能转化效率(ΦPSⅡ)、非循环光合电子流速率(ETR)、光化学淬灭系数(qP)和非光化学淬灭系数(qN)、叶片表观量子效率(α)，测定前均暗适应20 min。

1.3 数据处理

采用 Excel进行试验数据整理和图表绘制。用软件DPS 7.05对试验数据进行方差分析，差异显著性检验采用Duncan’s新复极差法。

2 结果与分析

2.1 稻瘟病菌毒素处理后冈优725叶绿素荧光参数的方差分析

由表1可以看出，除稻瘟病菌生理小种对冈优725叶片α以及毒素浓度对Fo和α的影响不显著外，水稻生育时期、稻瘟病菌生理小种以及毒素浓度对水稻叶片叶绿素各荧光参数均存在显著或极显著影响，且水稻生育时期与稻瘟病菌生理小种对所有叶绿素荧光参数存在极显著的互作效应。水稻生育时期对所有叶绿素荧光参数的影响效果大于稻瘟病菌生理小种及其毒素浓度，生理小种对Fv/Fm、Fv/Fo、ETR的影响程度小于毒素浓度，对Fo、ΦPSⅡ、qN、qP的影响程度大于毒素浓度。

表 1 稻瘟病菌毒素处理后冈优725叶绿素荧光参数的方差分析(F值)

2.2 稻瘟病菌毒素处理后不同生育时期冈优725叶绿素荧光参数的变化规律

由表2可以看出，经稻瘟病菌毒素处理后，冈优725不同生育时期叶绿素荧光参数存在显著差异。在孕穗期，冈优725叶片的Fo显著高于其他生育时期，qN处于较高水平，而其余叶绿素荧光参数均最低，说明孕穗期对稻瘟病菌毒素最敏感。在拔节期，叶绿素各荧光参数的变化趋势与孕穗期相反，Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSⅡ、qP、ETR均显著高于其他生育时期，α处于较高水平，说明拔节期是水稻对稻瘟病菌毒素耐受力最强的时期。在分蘖盛期、齐穗期和成熟期，Fv/Fo、ΦPSⅡ、qP差异不显著。在齐穗期，Fv/Fm和qN显著低于分蘖盛期和成熟期。在成熟期，Fo显著低于分蘖盛期和齐穗期。在成熟期、齐穗期和分蘖盛期，α差异显著。分蘖盛期的ETR显著低于成熟期。

表 2 稻瘟病菌毒素处理后不同生育时期冈优725叶绿素荧光参数的变化规律

2.3 不同生理小种稻瘟病菌毒素对冈优725叶绿素荧光参数的影响

由图1可见，不同生理小种稻瘟病菌毒素对冈优725叶绿素荧光参数的影响存在显著差异。稻瘟病菌不同生理小种毒素处理后，冈优725叶片的Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSⅡ、ETR、qP、qN、α显著低于对照，而Fo显著高于对照。ZA10毒素处理后Fv/Fm和Fv/Fo显著低于其他3个生理小种，且分别比对照低1.11%和8.78%；ZA10处理的Fo显著高于ZA14和ZC11，且比对照高12.29%。ZA10、ZA14、ZA18的ΦPSⅡ和ETR显著低于ZC11，其中ΦPSⅡ分别比对照低3.09%，3.33%，3.75%，ETR分别比对照低3.04%，4.00%，4.025。除ZA10和ZA14外，各生理小种间qN差异显著，ZA10、ZA14、ZA18和ZC11 4个生理小种分别比对照低16.77%，16.13%，7.88%和13.52%。ZA14的qP显著低于ZA10和ZC11，ZA18显著低于ZC11，ZA10、ZA14、ZA18和ZC11 4个生理小种毒素使得qP分别比对照降低2.09%，3.49%，3.84% 和1.39%。ZA10、ZA14、ZA18和ZC11 4个生理小种毒素对α的影响程度无显著差异，分别比对照降低1.17%，1.98%，2.17%和1.63%。

ZA10毒素处理后，冈优725叶片Fv/Fm和Fv/Fo均显著低于其他生理小种，ΦPSⅡ、qN、ETR、qP和α也均处于较低水平，而Fo显著高于ZA14和ZC11，说明在4个生理小种中ZA10毒素对光系统的影响最大。

图 1 不同生理小种稻瘟病菌毒素处理后冈优725叶绿素荧光参数的变化规律

2.4 稻瘟病菌毒素浓度对冈优725叶绿素荧光参数的影响

由表3可以看出，稻瘟病菌毒素处理冈优725后，除Fo外均会显著降低各叶绿素荧光参数。α和Fo在不同浓度毒素间差异不显著；稻瘟病菌毒素原液处理后，其他各指标Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSⅡ、qN、qP、ETR均显著低于稀释1倍处理，分别较稀释1倍处理降低1.71%，6.62%，0.86%，3.51%，3.23%，3.60%，说明随着浓度的增高，稻瘟病菌毒素对水稻叶绿素荧光参数的影响作用增强。

表 3 不同浓度稻瘟病菌毒素处理后冈优725叶绿素荧光参数的变化

3 讨 论

3.1 稻瘟病菌毒素对杂交水稻光系统各荧光参数的毒害机制

叶绿素荧光参数能直观地反映植物PSⅡ能量转换与传递情况，是衡量逆境胁迫对光合器官伤害的一个有效探针。Fv/Fm常用来度量植物叶片 PSⅡ 潜在活性和原初光能转化效率的高低，其值可以反映植物受胁迫程度[14]。Fv/Fo代表 PSⅡ潜在光化学活性。在本试验中，4个生理小种稻瘟病菌毒素处理后冈优725叶片Fv/Fm和Fv/Fo均显著降低，说明毒素可能引起了叶片类囊体膜受损和反应中心破坏，最终导致光抑制，阻碍了光合电子传递。许晓明等[15]研究表明，强光会导致水稻PSⅡ的反应中心发生可逆失活，从而使Fo显著升高。本研究中Fv/Fm的降低程度(1.11%)较Fv/Fo(8.78%)差，说明Fo升高可能还由PSⅡ结构受到轻微抑制或发生可逆失活引起，在本试验条件下Fv/Fo比Fv/Fm更能表征稻瘟病菌毒素对水稻光系统的影响。

ΦPSⅡ即PSⅡ的实际光能转化效率，反映PSⅡ反应中心在部分关闭情况下的原初光能捕获效率；ETR反应PSⅡ的电子传递活性大小。研究发现，重金属、低温和干旱等胁迫会引起ΦPSⅡ、ETR显著降低[6-8]。本研究中，稻瘟病菌毒素处理后，ΦPSⅡ和ETR均显著下降，说明毒素也会抑制水稻PSⅡ的结构和功能，导致PSⅡ反应中心的光能捕获效率和PSⅡ的电子传递活性显著下降。

qP是PSⅡ天线色素吸收的光能用于光化学电子传递的份额，反映了PSⅡ反应中心的开放程度。qN即非光化学淬灭系数，反映的是 PSⅡ吸收的光能不能用于光合电子传递而以热的形式耗散的光能部分。鲁艳等[16]研究发现，Ni、Cu会导致骆驼蓬qP显著降低，而qN显著升高，以增加用于非光化学反映如热耗散等的比例，达到光保护的作用。而本研究发现，稻瘟病菌毒素处理后，水稻qP和qN均显著降低，这与姜述君等[12]和徐红霞等[17]的研究结果一致，说明毒素可能损坏PSⅡ反应中心，电子由 PSⅡ 的氧化侧向 PSⅡ反应中心的传递受阻，同时，过量光能却不能通过热或其他形式耗散，光保护削弱。

本试验结果显示，稻瘟病菌毒素处理冈优725后，其Fv/Fo、Fv/Fm、ΦPSⅡ、qP和 qN均显著降低，而Fo显著升高，这与一些除草剂对植株光系统的毒害效应相似[18]，说明稻瘟病菌毒素中某些成分也可能充当了PSⅡ抑制剂，凭借较高的结合力取代QB并抑制QA至QB 的电子传递[19]。进一步分离和提纯稻瘟病菌毒素成分，研究单一成分对水稻系统的影响，将能更加明确毒素的毒害机理并有望开发新型禾本科除草剂。

3.2 不同生育时期对稻瘟病菌毒素的耐受性差异

稻瘟病菌毒素处理冈优725前，其Fv/Fm、Fv/Fo 在孕穗期最高，且与拔节期差异不显著，而毒素处理后，水稻叶片Fv/Fm、Fv/Fo在孕穗期最低，拔节期最高，说明毒素打破了水稻荧光参数原来的变化规律，这是由于不同生育期水稻对稻瘟病菌毒素的敏感程度不同造成的。水稻孕穗期对稻瘟病菌毒素最敏感，拔节期对稻瘟病菌毒素耐受力最强。

3.3 不同生理小种对叶绿素荧光参数影响的差异

不同生理小种毒素对冈优725叶片荧光参数的影响程度不同，这与郭连安等[20]的研究结果，不同稻瘟病菌生理小种对水稻防御酶活性的影响表现较一致，可能与不同稻瘟病菌生理小种毒性基因及毒性表现不同有关[21]。ZA10毒素处理的Fv/Fm和Fv/Fo均显著低于其他生理小种，ΦPSⅡ、qP、ETR、qP和α也均处于较低水平，而Fo显著高于ZA14和ZC11，说明ZA10对冈优725光系统的毒害作用最强。此外，冈优725叶绿素荧光参数对稻瘟病菌毒素的敏感程度随着毒素浓度增加而增强。

[参考文献]

[1] 胡运高,谢崇华,杨国涛,等.稻瘟菌毒素对水稻生理生化的影响 [J].湖北农业科学,2011,50(1):4-8.

Hu Y G,Xie C H,Yang G T,et al.Effect of toxins fromPyriculariaoryzaeCav on physiological and biochemical indexes of rice [J].Hubei Agriculture Science,2011,50(1):4-8.(in Chinese)

[2] 李 楠,凌英华,陈春燕,等.抗稻瘟病细胞突变体筛选技术体系的建立 [J].西南师范大学学报:自然科学版,2008,33(3):52-56.

Li N,Ling Y H,Chen C Y,et al.Establish of a technical system for screening rice(OryzasativaL.Subsp.indica) somatic mutant resistance to blast [J].Journal of Southwest China Normal University:Natural Science Edition,2008,33(3):52-56.(in Chinese)

[3] 郑秋玲.稻瘟病毒素对水稻根冠活细胞的影响研究 [J].安徽农学通报,2007,13(4):125-126.

Zheng Q L.Study for effect of rice blast toxin to the rice root cap living cells [J].Anhui Agri Sci Bull,2007,13(4):125-126.(in Chinese)

[4] 潘哲超,陈建斌,范静华,等.稻瘟菌粗毒素对水稻防御性相关酶系的诱导 [J].云南农业大学学报，2008,23(2):162-166.

Pan Z C,Chen J B,Fan J H,et al.Activities of defense-related enzymes induced by grude toxin fromMagnaporthegrisea[J].Journal of Yunnan Agricultural University,2008,23(2):162-166.(in Chinese)

[5] Maxwell K,Johnson G N.Chlorophyll fluorescence-Apracticalguide[J].Journal of Experimental Botany,2000,51:659-668.

[6] 王 帅,梁 英,冯力霞,等.重金属胁迫对杜氏盐藻生长及叶绿素荧光特性的影响 [J].海洋科学,2010,34(10):38-48.

Wang S,Liang Y,Feng L X,et al.Effects of heavy metal exposure on the growth and chlorophyll fluorescence ofDunaliellasalina[J].Marine Sciences,2010,34(10):38-48.(in Chinese)

[7] 代微然,任 健,墨继光.干旱胁迫对假俭草叶绿素荧光特性的影响 [J].草原与草坪,2010,30(5):1-5.

Dai W R,Ren J,Mo J G.Effects of drought stress on features of chlorophyll fluorescenca ofEremochoaophiuroides[J].Grassland and Turf,2010,30(5):1-5.(in Chinese)

[8] 杨华庚,林位夫.低温胁迫对油棕幼苗光合作用及叶绿素荧光特性的影响 [J].中国农学通报,2009,25(24):506-509.

Yang H G,Lin W F.The effect of low temperature stress on photosynthesis and chlorophyll fluorescence characteristics in oil palm seedlings [J].Chinese Agricultural Science Bulletin,2009,25(24):506-509.(in Chinese)

[9] 张园园,徐秀德,王振东,等.高粱靶斑病菌侵染对高粱光系统Ⅱ的影响 [J].作物杂志,2012(2):42-46.

Zhang Y Y,Xu X D,Wang Z D,et al.Fusarium population and pathogenicity of pea root rot in the cold and humid regions of Gansu Province [J].Crops,2012(2):42-46.(in Chinese)

[10] 于 力,阎 君,郭世荣，等.番茄黄化曲叶病毒侵染对番茄叶片光合及荧光特性的影响 [J].上海农业学报,2012,28(3):22-25.

Yu L,Yan J,Guo S R,et al.Effects of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) infection on photosynthetic and fluorescent characteristics of tomato leaves [J].Acta Agriculture Shanghai,2012,28(3):22-25.(in Chinese)

[11] 王北洪,黄木易,马智宏,等.条锈病对冬小麦叶绿素荧光、光合及蒸腾作用的影响 [J].华北农学报,2004,19(2):92-94.

Wang B H,Huang M Y,Ma Z H,et al.Effects of stripe rust on chlorophyll fluoreseence and photosynthesis of winter wheat [J].Acta Agriculturae Boreali-Sinica,2004,19(2):92-94.(in Chinese)

[12] 姜述君,强 胜.马唐生防菌画眉草弯孢霉毒素α,β-dehydrocurvularin 对马唐叶片PSⅡ功能的影响 [J].中国农业科学,2005,38(7):1373-1378.

Jiang S J,Qiang S.The effect of the mycotoxin of α,β-dehydrocurvularin fromCurvulariaeragrostidison PSⅡ inDigitariasanguinalis[J].Scientia Agricultura Sinica,2005,38(7):1373-1378.(in Chinese)

[13] 刘玉晓,龚丽丽,刘 芳,等.链格孢菌毒素对莱茵藻光系统Ⅱ的多重影响 [J].西北植物学报,2008,28(1):119-124.

Liu Y X,Gong L L,Liu F,et al.Multiple effects of AAC-toxin on PSⅡ ofChlamydomonasreinhardii [J].Acta Bot Boreal-Occident Sin,2008,28(1):119-124.(in Chinese)

[14] Megdiche W,Hessini K,Gharbi F,et al.Photosynthesis and photosystem efficiency of two salt-adapted halophytic seashoreCakilemaritimaecotypes [J].Photosynthetica,2008,46(3):410-419.

[15] 许晓明,张荣铣,唐运来.低叶绿素含量对突变体水稻吸收光能分配特性的影响 [J].中国农业科学,2004,37(3):339-343.

Xu X M,Zhang R X,Tang Y L.Effect of low content chlorophyll on distribution properties of absorbed light energy in leaves of mutant rice [J].Scientia Agricultura Sinica,2004,37(3):339-343.(in Chinese)

[16] 鲁 艳,李新荣,何明珠,等.不同浓度 Ni、Cu 处理对骆驼蓬光合作用和叶绿素荧光特性的影响 [J].应用生态学报,2011,22(4):936-942.

Lu Y,Li X R,He M Z,et al.Influence of different concentration Ni and Cu on the photosynthesis and chlorophyll fluorescence characteristics ofPeganumharmala[J].Chinese Journal of Applied Ecology,2011,22(4):936-942.(in Chinese)

[17] 徐红霞,翁晓燕,毛伟华,等.镉胁迫对水稻光合、 叶绿素荧光特性和能量分配的影响 [J].中国水稻科学,2005,19(4):338-342.

Xu H X,Weng X Y,Mao W H,et al.Effects of cadmium stress on photosynthesis,chlorophyll fluorescence characteristics and excitation energy distribution in leaves of rice [J].Chinese J Rice Sci,2005,19(4):338-342.(in Chinese)

[18] Demmig B,Winter K.Photoinhibition and zeaxanthin formation in intact leaves [J].Plant Physiology,1987,84:218-224.

[19] Oettmeier W.Herbicide resistance and supersensitivity in ph-otosystemⅡ [J].Cell Mol Life Sci,1999,55:1255-1277.

[20] 郭连安,张 玲,胡运高,等.稻瘟菌粗毒素对水稻幼苗生理生化的影响 [J].贵州农业科学,2011,39(10):105-107.

Guo L A,Zhang L,Hu Y G,et al.Influence of crudeMagnaporthegriseatoxin on physiology and biochemistry of rice seedings [J].Guizhou Agricultural Sciences,2011,39(10):105-107.(in Chinese)

[21] 范静华,周惠萍,王洪海,等.稻瘟病菌生理小种及其毒性 [J].植物保护,2005,31(6):29-31.

Fan J H,Zhou H P,Wang H H,et al.Studies on physiological races and virulence ofMagnaporthegriseain Yunnan Province [J].Plant Protection,2005,31(6):29-31.(in Chinese)