褚达明，王丹波，李妍，刘岿然

（中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳110004）

子宫内膜异位症异位内膜及在位内膜中BRAF基因的表达及意义

褚达明，王丹波，李妍，刘岿然

（中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳110004）

目的探讨BRAF基因在子宫内膜异位症异位内膜及在位内膜中的表达。方法采用实时聚合酶链反应技术及免疫组织化学SP法检测20例子宫内膜异位症患者的异位内膜和在位内膜及20例对照组正常子宫内膜中BRAF的表达。结果在位内膜中BRAFmRNA相对表达量（0.000 067 897 0±0.000 114 528 6）明显高于正常内膜（0.000 009 543 1±0.000 006 454 3）（P＜0.05），而异位内膜（0.000 029 395 7±0.000 038 046 9）与在位内膜之间差异无统计学意义（P＞0.05）。异位内膜和在位内膜中BRAF蛋白的阳性表达率和表达强度均明显高于正常内膜（P＜0.05），而异位内膜和在位内膜之间阳性表达率及表达强度的差异无统计学意义（P＞0.05）。结论在位内膜BRAF基因高表达可能在子宫内膜异位症发生中起重要作用，而与病情进展的相关性有待进一步验证。

子宫内膜异位症；BRAF；子宫内膜；实时定量聚合酶链反应；免疫组化

子宫内膜异位症是一种多病因引起的慢性炎性疾病，其特征为具有生长功能的子宫内膜（腺体和间质）组织出现在子宫腔被覆黏膜以外部位［1］。该病常发生于生育年龄的妇女，发病率为10%～20%。慢性盆腔痛、不孕及包块是其主要临床特点。其病因及发病机制至今尚未完全阐明，造成治疗上的困难。目前研究认为子宫内膜异位症是一种病因复杂的多基因遗传的疾病［2］。我们选择了本课题组前期通过cDNA代表差异性分析技术筛查出的子宫内膜异位症差异性高表达基因之一的BRAF基因［3］，应用实时定量聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）技术及免疫组织化学法检测其在子宫内膜异位症患者异位内膜和在位内膜中的表达，为子宫内膜异位症的发病机制提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源

选择2013年1月至12月在中国医科大学附属盛京医院妇产科行开腹或腹腔镜手术治疗的子宫内膜异位症患者20例为实验组，手术同时行全子宫切除术，病理学诊断结果证实为子宫内膜异位症，术后立即留取异位病灶和在位内膜。对照组为同期无子宫内膜异位症的正常子宫内膜标本20例。研究对象年龄23～50岁，实验组年龄（36.9±8.7）岁，对照组年龄（38.5±6.4）岁（P＞0.05），具有可比性。全部病例无其他内分泌、免疫及代谢性疾病，手术前3个月内未接受激素治疗。根据月经周期及病理确认标本均为分泌期留取。所有标本分为两部分，一部分放入10%甲醛中固定用来做免疫组化，另一部分放入液氮中冷冻用来做RT-PCR。实验经本院伦理委员会审批通过，均签署知情同意书。

1.2 RT-PCR检测BRAFmRNA表达

严格按照TaKaRa公司的RNA提取试剂盒（TrizolTMRNA Isolation Reagent）中的说明书进行操作，从每份冷冻标本中提取总RNA。使用Prime-Script®第一链cDNA合成试剂盒合成cDNA第一链，并在-20℃下保存用来进一步扩增。按操作说明使用TaKaRa公司的SYBR®PrimeScriptTMreal-time PCR试剂盒进行RT-PCR反应。应用Primer 5.0软件，参照BRAF基因序列设计特异引物，上游引物为5′-GGCAGAGTGCCTCAAAAAGAA-3′，下游引物为5′-AACCAGCCCGATTCAAGGA-3′，以18 s基因作为内部对照。使用LightCycler®2.0 RT-PCR系统进行45个循环的2步法扩增，即95℃20 s，60℃1 min。实验结果分析采用相对定量方法，即BRAFmRNA的相对表达量=2-ΔCt，ΔCt=CtBRAF基因-Ct对照基因。

1.3 免疫组织化学法检测BRFA蛋白表达

免疫组化采用SP法，石蜡包埋标本，4 μm厚切片，常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水。一抗为兔抗人BRAF多克隆抗体（美国Signalway Antibody），用免疫组化SP试剂盒（福州迈新）检测BRAF蛋白的表达。将组织切片放入柠檬酸盐缓冲剂中加热至沸腾，持续5 min，进行抗原修复，后加入1%H2O2阻断灭活内源性过氧化物酶，随后在室温下加入5%的正常羊血清工作液封闭30 min，后加入抗原浓度为1∶200的一抗，4℃冰箱过夜，后滴加生物素标记二抗，在室温下作用30 min，再滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液作用20 min，DAB染色20 s，苏木素复染。以PBS液置换一抗作为阴性对照。结果判定：细胞质染色，出现棕褐色、棕黄色或淡黄色颗粒为阳性染色。根据细胞染色强度和染色细胞所占面积积分之和进行判断。染色强度评分标准：不着色为0分，黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3分。染色面积评分标准：无细胞染色为0分，≤25%为1分，26%～50%为2分，≥50%为3分。两种评分相加，0～1分为（-），2分为（+），3～4分为（++），5～6分为（+++）。阳性表达率=（+～+++级的例数/各组总例数）×100%。

1.4 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析取得结果，计量资料多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，计数资料多组间阳性率比较采用χ2检验，等级资料多组间表达强度比较采用Kruskal-Wallis H检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 子宫内膜异位症异位内膜及在位内膜BRAFmRNA表达

以18s基因作为内部对照，子宫内膜异位症组异位内膜与在位内膜BRAFmRNA表达量分别为0.000 029 395 7±0.000 038 046 9及0.000 067 897 0± 0.000 114 528 6，二者比较无统计学差异（P＞0.05）；对照组正常内膜表达量为0.000 009 543 1± 0.000 006 454 3，与子宫内膜异位症组在位内膜比较有统计学差异（P＜0.05）。见图1。

图1 子宫内膜异位症异位内膜及在位内膜中BRAF mRNA相对表达量Fig.1 Relative expression of BRAF mRNA in ectopic，eutopic endometrium of endometriosis

2.2 子宫内膜异位症异位内膜及在位内膜BRAF蛋白表达

BRAF蛋白免疫组织化学染色情况：阳性反应物呈棕黄色或棕褐色颗粒，主要表达在子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的胞质内。BRAF蛋白在异位内膜、在位内膜及正常内膜中均有表达，其阳性表达率分为为55%（11/20）、60%（12/20）和10%（2/ 20）。如图2所示，BRAF在子宫内膜异位症异位内膜胞质内大量表达，可见棕黄色染色颗粒，呈阳性反应。BRAF在子宫内膜异位症在位内膜胞质内大量表达，可见棕褐色染色颗粒，呈强阳性反应。BRAF在正常分泌期子宫内膜胞质内少量表达，可见淡黄色染色颗粒，呈弱阳性反应。子宫内膜异位症组异位内膜与在位内膜中BRAF蛋白的阳性表达率及表达强度均无明显差异（P＞0.05）。而异位内膜、在位内膜分别与对照组正常内膜比较，阳性表达率及表达强度均有统计学差异（P＜0.05）。见图3。

图2 免疫组化SP法检测子宫内膜异位症异位内膜及在位内膜中BRAF蛋白的表达×400Fig.3 The expression of BRAF protein measured by immunohistochemistry in ectopic，eutopic endometrium of endometriosis×400

图3 BRAF蛋白在各组内膜中的表达强度构成Fig.3 The proportion of BRAF protein in groups

3 讨论

子宫内膜异位症是一种雌激素依赖性的炎性疾病，是育龄妇女的常见病和多发病，与不孕和慢性盆腔痛关系密切，近年来发病率呈逐年上升趋势，严重影响患者的生殖健康和生活质量。尽管有众多解释子宫内膜异位症发生的学说，但最被广为接受的是子宫内膜种植学说，即月经期经血逆流，子宫内膜细胞和碎片随经血逆流至腹腔，进而种植于卵巢和盆腔腹膜，形成子宫内膜异位症病灶［4］。然而，经血逆流在育龄期妇女中的发生率约为70%～80%，而子宫内膜异位症的发病率只有10%～15%，这说明子宫内膜的侵袭性种植是一个多因素参与的复杂过程。

越来越多的证据表明子宫内膜异位症患者的在位内膜存在内源性异常，使其易于迁徙和种植，从而导致子宫内膜异位症的发生和发展［5，6］。而内膜的侵袭性种植涉及多条信号传导通路的相互协调，其中有丝分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信号通路起到重要作用［2］。MAPK是各细胞信息从细胞外转导到细胞核的重要传递者，是刺激细胞增殖、生存、分化的交汇点或共同通路。其变更会导致信号传导的不平衡，引起细胞增殖失控。已有研究证实，在多种人类肿瘤组织及肿瘤细胞系中，MAPK信号转导通路异常表达或异常活化，提示该通路调控异常，与肿瘤关系密切［7］。2004年Yoshino等［8］阐述了MAPK通路与子宫内膜异位症的关系。认为MAPK通路能够影响多种细胞因子的表达和功能，其上调对子宫内膜异位症异位内膜的生长和种植起到重要作用［9，10］。

BRAF基因，全名为鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌基因同源体B1，是1988年由Ikawa等［11］首先在人类尤文氏肉瘤中发现并克隆确认的，是一个能转染NIH3T3细胞且有活性的DNA序列，与ARAF和CRAF（RAF-1）同属RAF家族，是一种癌基因，其编码的BRAF蛋白为MAPK激酶的激酶［12］，是MAPK激酶家族里最高效的磷酸化剂，它位于MAPK通路入口处，调节细胞的增殖、分化和凋亡。BRAF突变后持续性激活MAPK通路，使前有丝分裂原有效分裂能力增强，导致细胞异常增殖和分化。自Davies等［13］报道约66%的恶性黑色素瘤和15%的结肠癌中BRAF基因存在体细胞错义突变后，该基因与肿瘤关系的研究渐成热点。本课题组通过cDNA代表差异性分析技术筛查出BRAF基因为子宫内膜异位症差异性高表达基因之一［3］，但其在子宫内膜异位症中的表达尚不清楚。Yotova等［14］研究发现子宫内膜异位症在位内膜与正常子宫内膜中BRAF基因水平相似，但在位内膜中BRAF基因的活化率高于正常子宫内膜，从而使MAPK信号通路被异常激活，细胞外信号调节激酶持续活化，导致在位内膜细胞高速增殖。故即使在相同的外部刺激和环境下，在位内膜更易增殖、迁徙。

本研究也显示，子宫内膜异位症在位内膜中BRAFmRNA相对表达量、BRAF蛋白阳性表达率及表达强度均明显高于正常内膜，证明子宫内膜异位症在位内膜BRAF基因表达及活性均明显强于正常内膜，与Yotova等［14］的研究结果相似，因此有理由推测，子宫内膜异位症在位内膜中BRAF基因的活化率增高，进而使其转录的mRNA水平增高，高水平的BRAFmRNA又使其编码的BRAF蛋白高表达，从而持续激活MAPK信号通路，使在位内膜细胞生长和分化调节失控，从而导致在位内膜细胞更易增殖、迁徙，形成子宫内膜异位症。BRAF基因有可能是MAPK信号通路上游调控基因之一，在子宫内膜异位症发生中起重要作用，有待进一步验证。在子宫内膜异位症发生、发展中，BRAF基因是否在其病情进展中持续发挥作用，目前少见报道。本研究结果显示，子宫内膜异位症组异位内膜与在位内膜比较，BRAFmRNA表达及蛋白阳性表达率及表达强度均无差异，似与子宫内膜异位症发展无关，但子宫内膜异位症病变广泛性、病理多态性特点［1］导致异位病灶中异位内膜细胞含量不确定因素可能是影响本研究结果的因素之一，有待进一步扩大样本量、增加细胞模型及动物模型等多层次深入研究。

综上所述，本研究检测了BRAF在子宫内膜异位症中的表达情况及表达部位，其在异位及在位内膜中的高表达与子宫内膜异位症的发生相关，证明BRAF基因在在位内膜的高表达是子宫内膜异位症发病机制之一，而其在病情进展中的作用及其进一步的多层次研究及机制研究值得关注。

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（编辑 陈姜）

Expression and Significance of BRAF Gene in Ectopic Endometrium ofWomen with Endometriosis

CHUDa-ming，WANGDan-bo，LIYan，LIUKui-ran
（DepartmentofObstetrics and Gynecology，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate the expression ofBRAFin ectopic and eutopic endometrium ofwomen with endometriosis.MethodsQuantitative real-time polymerase chain reaction（RT-PCR）and immunohistochemistry SP method were adopted to measure theBRAFexpression in ectopic and eutopic endometrium（n=20）ofpatientswith endometriosis，as wellas normalendometrium（n=20）ofwomen withoutendometriosis.Re⁃sultsRelative expression ofBRAFmRNA in eutopic endometrium（0.000 067 897 0±0.000 114 528 6）was significantly higher than that in control group（0.000 009 543 1±0.000 006 454 3）（P＜0.05），but no difference was found between the ectopic（0.000 029 395 7±0.000 038 046 9）and eutopic group（P＞0.05）.The expression rate and intensity of BRAF in ectopic and eutopic endometrium was significantly higher than the control group（P＜0.05）；however，there was no significant difference between ectopic and eutopic endometrium（P＞0.05）.ConclusionThe high expression ofBRAFin eutopic endometrium may play a crucial role in the occurrence of endometriosis，while the correlation with disease progression needsto be furtherverified.

endometriosis；BRAF；endometrium；quantitative real-time polymerase chain reaction；immunohistochemistry

R711.71

A

0258-4646（2014）09-0790-04

国家自然科学基金（81070467，81270675）；“盛京自由研究者”基金（201204）

褚达明（1985-），男，医师，硕士.

王丹波，E-mail：wangdb@sj-hospital.org

2014-06-18

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