陈虞超 张丽 巩檑 甘晓燕 石磊 宋玉霞

（宁夏农业生物技术重点实验室，银川 750002）

抗虫转基因银河杨的生长特性和抗虫性

陈虞超 张丽 巩檑 甘晓燕 石磊 宋玉霞

（宁夏农业生物技术重点实验室，银川 750002）

以非转基因银河杨（Populus alba×Populus hopeiensis）为对照，对抗虫转基因银河杨抗虫基因Cry3A的稳定性，转基因银河杨的物候期、生长状况和抗虫性进行研究。结果发现，Cry3A基因整合稳定，在根、茎、叶中RNA和蛋白水平均有表达，不同组织中Bt蛋白水平差异显著，茎中Bt蛋白水平最高。抗虫转基因银河杨的物候期、生长状况未发生显著变化，但表现出显著的抗虫性。

抗虫转基因银河杨 Cry3A基因 物候期 生长状况 抗虫性

杨树（Populus L.）生长快，适应性强，用途广，是我国人工速生用材基地建设的主要造林树种，影响杨树丰产林发展最大的障碍为病虫危害，其中虫害尤甚。杨树的害虫主要分为食叶害虫和蛀干害虫，食叶害虫以鳞翅目（Lepidoptera）的杨尺蠖（Apocheima cinerarius）和舞毒蛾（Lymantria dispar）、杨扇舟蛾（Clostera anachoreta）为主，蛀干害虫以鞘翅目（Coleoptera）的光肩星天牛（Anoplophora glabripennis）、桑天牛（Apriona germari）、云斑天牛（Batocera horsfieldi）为主［1，2］。防治这些害虫的传统方法如化学药物防治和人工捕捉等具有一定局限性，因此从20世纪80年代开始，我国开展了抗虫转基因杨树培育的研究。众多研究者通过转基因技术将苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）等外源抗虫基因，导入不同杨树品种中，成功培育出一系列性状优良的抗虫转基因杨树，其中部分已进入环境释放或商品化阶段［3-8］。Cry3A为Bt蛋白编码基因之一，对鞘翅目昆虫具有专一的毒杀作用，在抗虫转基因杨树的培育中应用较多［9-11］。目前有关抗虫转基因杨树培育和利用的研究较多，针对抗虫转基因杨树生长特性和抗虫性变化的跟踪研究较少。鉴于此，本研究以普通银河杨为对照，对已育成的转Cry3A抗虫基因银河杨抗虫基因的稳定性，物候期、生长状况和抗虫性变化进行较系统

的对比研究，旨在为抗虫基因银河杨下一步推广应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

转Cry3A抗虫基因银河杨［银白杨（Populus alba L.）×河北杨（Populus hopeiensis Hu et chow）］以CaMV35S为Cry3A基因的启动子，由宁夏农业生物技术重点实验室培育，并于2004年种植于宁夏回族自治区银川市宁夏农林科学院芦花台园林场（东经10608'、北纬3838'）。测试昆虫为人工饲养的鞘翅目（Coleoptera）天牛科（Cerambycidae）的光肩星天牛（Anoplophora glabripennis）。DNA提取试剂盒购自TIANGEN公司（货号：DP305-02），RNA提取试剂盒购自全式金公司（货号：ET121-01），RTPCR试剂盒GoScriptTMReverse Transeription System购自Promega公司，Bt-Cry3A的ELISA测定试剂盒购自于Agdia公司（货号：PSA05900），其他试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 抗虫转基因银河杨Cry3A基因的PCR与RT-PCR检测 提取抗虫转基因银河杨DNA，利用PCR方法检测Cry3A基因的稳定性，引物序列为：5'-ATGACTGCTGATAACAACACGGA-3'和 5'-TTAATTCACTGGAATGAACTCA-3'，扩增片段大小为1 794 bp。PCR体系为10×buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，引物各1.0 μL，Taq 1.0 μL，DNA 1.5 μL，ddH2O 17 μL，总体积25 μL。扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性40 s，53℃复性40 s，72℃延伸1 min，循环35次；72℃保温10 min。7月中旬，采集转基因银河杨根、茎、叶，采用试剂盒法提取抗虫转基因银河杨的总RNA，以杨树的ubiquitin基因（Gene ID：7464783）为内标，利用RT-PCR检测抗虫基因Cry3A的反转录情况；Cry3A的RTPCR引物同PCR引物一致，内标基因ubiquitin的引物序列为：5'-TGAGGCTTAGGGGAGGAACT-3'和5'-TGTAGTCGCGAGCTGTCTTG-3'，扩增片段大小为195 bp；扩增程序参照试剂盒说明书。

1.2.2 抗虫转基因银河杨Bt蛋白的检测 于7月中旬，采集抗虫转基因银河杨根、茎、叶组织，然后测定根、茎、叶中Bt蛋白的含量，具体过程参照试剂盒说明书进行，用Bio-Rad xMarkTM酶标仪测定结果。

1.2.3 抗虫转基因银河杨生长特性调查 采用随机抽样法，选取抗虫转基因银河杨（简称TG）和普通银河杨（简称CK）调查样株各30株，从2012-2013年，连续2年对所有样株的生长物候期（包括芽萌动期、芽开放期、花序孕期、展叶始期、开花期、展叶盛期、封顶期、叶始黄期、叶黄盛期、落叶初期、落叶盛期）和形态特性（包括株高、胸径、地径、分支数、郁闭度）进行观测。

1.2.4 抗虫转基因银河杨室内抗虫性鉴定 于7月中旬，分别采集抗虫转基因银河杨、普通银河杨植株的幼嫩枝叶，以容量为1 L的带透气盖塑料培养瓶为饲养容器，饲喂光肩星天牛成虫，每瓶3头，每个处理组10瓶，每2 d换一次新鲜枝叶，重复3次，统计两个试验组光肩星天牛成虫15 d内总死亡率和死亡指数。

总死亡率（%）=（饲养末期死亡总数/初期饲养总数）×100%

死亡指数=（∑天数×当天死亡数）/（总死亡数×试验总天数）

2 结果

2.1 抗虫转基因银河杨Cry3A基因的PCR检测

通过PCR方法检测Cry3A基因在抗虫转基因银河杨植株中的稳定性，结果如图1所示，抗虫转基因银河杨植株的PCR扩增产物中，均存在一条1 800 bp左右大小的条带，经测序比对与目的基因Cry3A同源性为100%。结果表明，Cry3A基因在抗虫转基因银河杨植株中稳定存在，未发生基因丢失的现象。

图1 抗虫转基因银河杨Cry3A基因的PCR扩增产物电泳图

2.2 抗虫转基因银河杨Cry3A基因的RT-PCR检测

通过RT-PCR方法检测Cry3A基因在不同组织中的RNA表达情况，结果如图2所示，在抗虫转基因银河杨植株根、茎、叶的RT-PCR扩增产物中，均存在一条1 800 bp左右大小的条带，经测序比对与目的Cry3A基因同源性为100%。结果表明，Cry3A基因在根、茎、叶中均能表达。

图2 抗虫转基因银河杨Cry3A基因RT-PCR扩增产物电泳图

2.3 抗虫转基因银河杨Bt蛋白检测

通过ELISA法检测Cry3A基因在不同组织中的Bt蛋白表达情况，结果如图3所示，抗虫转基因银河杨植株根、茎、叶中Bt蛋白水平分别为16、28和6 ng/g。结果表明，Cry3A基因在根、茎、叶中均能进行Bt蛋白表达，茎中水平最高；不同组织中Bt蛋白水平存在显著差异。

图3 抗虫转基因银河杨不同组织中Bt蛋白水平

2.4 抗虫转基因银河杨生物学特性分析

通过对抗虫转基因银河杨、普通银河杨的物候期进行对比调查，结果发现二者的物候期无显著差异（表1）。通过对抗虫转基因银河杨、普通银河杨的生长状况进行对比调查，结果发现二者在胸径年均生长量、地径年均生长量、株高年均生长量、分支数、郁闭度方面均无显著差异（表2）。

表1 转基因银河杨与普通银河杨物候期对比表

表2 转基因银河杨与普通银河杨生长状况对比表

2.5 转基因银河杨抗虫性分析

以普通银河杨为对照，通过实验室人工饲喂的方法，对比分析抗虫转基因银河杨的抗虫性，结果如表3所示，饲喂抗虫转基因银河杨和普通银河杨的光肩星天牛，总死亡率分别为86.7%、33.3%，死亡指数分别为0.62、0.24。表明抗虫转基因银河杨对光肩星天牛具有显著的抗性。

表3 转基因银河杨与普通银河杨抗虫性的对比分析

3 讨论

外源基因在转基因植株中丢失、沉默是植物基因工程应用中存在的主要问题。Meyer等［12］发现，转基因移栽至大田后，由于光照、温度等因素的影响，外源基因的失活程度更显著，失活的转基因植物数量也更多。但胡建军等［13］通过田间调查发现，7年生的转基因黑杨依然具有良好的抗虫性，外源抗虫基因表达正常。本研究对9年生的抗虫转基因银河杨部分植株进行PCR检测，发现Cry3A基因在转基因杨树植株中稳定存在，未发生基因丢失的现象。抗虫转基因银河杨以CaMV35S作为Cry3A基因的启动子，而CaMV35S属异源组成型启动子，在受体植株的不同组织器官中均可表达［14，15］。本研究发现，Cry3A基因在转基因银河杨植株的根、茎、叶均可表达，这可能是CaMV35S启动子的特性所决定的。不同组织间的表达量差异显著，这与姜志磊等［16］对抗虫转基因玉米的研究结论相似，推测这一现象可能与Bt蛋白的分泌方式、运输途径和方向等相关。

外源抗虫基因导入受体植株基因组，使受体植株表现出较好的抗虫性，但可能也会影响植株的新陈代谢，导致其生长特性等表型发生变化。吕淑平等［17］研究表明，外源Bt基因在增强转基因棉花抗性的同时，还影响了转基因棉花的株高等生长特性。但本研究发现，与普通银河杨相比，抗虫转基因银河杨在物候期、生长状况等生长特性方面不存在显著变化，这与刘海涛等［18］对抗虫转基因欧洲黑杨、杨敏生等［19］对转双抗虫基因741杨的研究结果一致。本研究还发现，与普通银河杨相比，抗虫转基因银河杨对光肩星天牛具有显著的抗性，这与张冰玉等［11］对转Cry3A基因银腺杨的相关研究结论一致。

4 结论

抗虫转基因银河杨（Populus alba×Populus hopeiensis）的物候期、生长状况未发生显著变化，但抗虫性显著；其抗虫基因Cry3A整合稳定，在根、茎、叶中RNA和蛋白水平均有表达，不同组织中Bt蛋白水平差异显著，茎中Bt蛋白水平最高。

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（责任编辑 李楠）

Growth Characteristic and Insect-Resistance of Transgenic Populus alba Populus hopeiensis

Chen Yuchao Zhang Li Gong Lei Gan Xiaoyan Shi Lei Song Yuxia
（Key Laboratory of Agricultural Biotechnology of Ningxia，Yinchuan 750002）

The stability of insect-resistance gene Cry3A, phenophase, growth status and insect-resistance of transgenic poplar hybrid（Populus alba×Populus hopeiensis）was investigated, non- transgenic Populus alba×Populus hopeiensis as control. The results showed that the Cry3A gene in transgenic Populus alba×Populus hopeiensis integrated stably. The Cry3A gene could be expressed at RNA level and protein level in root, shoot and leaf. The Bt protein level was significantly different in different tissues, and was highest in shoot. The phenophase and growth status of transgenic Populus alba×Populus hopeiensis changed indistinctively. But it showed distinct insect-resistance.

Insect-resistance transgenic Populus alba×Populus hopeiensis Cry3A gene Phenophase Growth status Insectresistance

2014-03-07

国家林业转基因生物安全性监测项目（JJ-2012-07）

陈虞超，男，硕士，助理研究员，研究方向：植物基因工程；E-mail：chenyuchao820321@163.com

宋玉霞，女，硕士，研究员，研究方向：植物分子生物学；E-mail：songyx666@163.com