郑超文， 肖娅萍

(陕西师范大学 生命科学学院，陕西 西安 710062)

兰科菌根真菌研究方法的概述

郑超文， 肖娅萍*

(陕西师范大学 生命科学学院，陕西 西安 710062)

兰科植物资源在全球分布广泛，其中有许多是重要的药用植物和名贵的珍稀花卉，由于具有较高的商业价值，受到各界人士的广泛关注。兰科植物生长习性的特殊性导致其在自然状态下繁殖率极低，因此难以满足市场的广泛需求。近年研究表明，几乎所有兰科植物都能与相应的菌根真菌建立共生关系，并且必须依赖于这些内生真菌才能完成其整个生活史。因而对菌根真菌在提高兰科植物生长速度和繁殖能力过程中机制的研究以及将研究成果运用于工业化育苗中将是缓解兰科植物市场供求紧张问题的关键。通过对近几年有关天麻和铁皮石斛等兰科植物的问题研究中所采用的研究方法加以阐述，以期对今后兰科菌根真菌的研究提供一定的参考。

兰科植物；菌根真菌；共生机制；研究方法

兰科植物作为自然界中的第二大科植物[1]，在世界范围内分布十分广泛，目前据统计约有800属，大约25 000种[2]。兰科植物由于其美丽的外观和清新的香味，备受人们青睐。除了作为观赏的花卉外，兰科植物中的石斛属(Dendrobium)和白及属(Bletilla beichb.f.)等作为重要的中药药材，具有多种疗效。例如铁皮石斛，可用于阴伤津亏，口干烦渴，食少干呕，病后虚热，目暗不明等症状的治疗[3-4]。正是由于其观赏性和药用价值，导致了市场需求量越来越大。然而目前兰科植物的种植通常采用传统的无性分株方式繁殖，产量低且增殖周期较长，难以满足市场的需求。随着科技的发展，组培脱毒快速繁殖技术的应用改善了兰科植物传统的生产方式，实现了兰花的大规模工厂化生产。但由于组培幼苗移栽时对环境要求较为严格，易受环境的影响出现倒伏，且投资成本较高而难以在民间普及。随着近些年菌根生物学的兴起，重新引起了人们对兰科植物快速繁殖的关注，力争在其与之共生的微生物中找到新的突破点。据现有的文献报道，菌根对多种植物的生长发育有促生作用，例如Alexander[5]于1984年研究发现：菌根可以通过增加植株对N、P元素的吸收来促进植物的生长发育。兰科植物也正是与特定的菌根真菌结合才能有效地从外界汲取养分。尽管相关学者从两者间的专一性、营养关系、协同进化以及共生关系形成的机制等不同角度进行了大量的基础性研究，但其促生机制仍未明了。本文对兰科植物与菌根真菌的研究中所采用的研究方法加以阐述，以期为从事相关研究的学者提供一定的参考。

1 兰科菌根的特点及其在生长发育中的作用

德国植物生理学和森林学家Frank于1885年首次提出“菌根”的概念：菌根是土壤中菌根真菌菌丝与高等植物营养根系形成的一种联合体，是自然界在长期的发展和进化过程中形成的一种特殊的植物与真菌共生的存在形式，它直接参与植物根系乃至整株植物的生理代谢活动[6]。自然界的菌根可分为丛枝菌根、外生菌根、内外菌根、浆果鹃类菌根、水晶兰类菌根、欧石楠类菌根和兰科菌根7大类。与其他菌根相比兰科植物的菌根有着特有的典型结构，例如兰科菌根的菌丝无哈蒂氏网和菌套，在宿主植物根部皮层细胞内常以菌丝团的形式存在，且菌丝团寿命很短，常常会被宿主细胞降解；消解后的菌丝残体逐渐被根部皮层细胞溶解和吸收，最后消失。而之后根部表皮细胞又会被重新侵染，形成了一个反复的循环侵染过程[6]。关于兰科菌根真菌侵染途径的说法有很多，目前公认有2种，一是菌根真菌侵染早期种子萌发时的胚根或成苗的根系细胞壁，进而与兰科植物的根系形成菌根互惠体；二是以块茎越冬的兰科植物也会通过上述相同的过程实现真菌对其根系组织的侵染[7]。菌丝分泌物质会降解宿主植物的细胞壁，在根部的皮层细胞之间通过菌丝相互连接成一个巨大的网络结构，从而进行物质与信息传递。

兰科植物的菌根对兰科植物各个阶段的生长和发育都有一定的促生作用，例如天麻除了在种子萌发阶段需要蜜环菌的侵染外，在其无性繁殖阶段同样需要蜜环菌为其生长发育提供营养[8]。实验结果表明，菌根真菌在兰科植物的生长发育中能够产生水解酶，消解兰科植物根细胞内的淀粉粒等营养物质，从而生成可被兰科植物直接吸收的营养物质促进兰科植物生长。有些菌根真菌也可以富集土壤中的N、P、K等元素传递给兰科植物，促进其生长。同时兰科植物反过来能够为菌根真菌的生长繁殖提供一定的营养物质，因而兰科植物和菌根真菌之间构成了一种独特的共生关系，也只有通过与真菌共生才能使兰科植物正常发育。

2 兰科菌根的研究方法

2.1种子萌发与菌根真菌的研究

由于兰科植物种子无胚乳且部分兰科植物的种子没有乙醛酸循环体和各种酶系，所以不能利用自身的营养物质获得营养，也就无法同其他植物一样进行正常的种子萌发和生长。因此兰科植物只有依靠不同于其他植物的生长结构才能满足叶绿素被机体合成前植物对营养物质的需求，而兰科植物与菌根真菌共生所形成的菌根结构则很好地起到了促进其正常生长的作用[9]。研究者们很早就注意到兰科植物的生长与真菌侵染有着密切的关系，如Link在1824年就发现真菌对兰科种子的感染一直伴随着兰科种子的萌发[10]。但是当时并未说明兰科植物的种子是如何与兰科植物进行共生。1899年Bemard通过兰花种子共生菌萌发的方法第一次分离出兰科植物的菌根，并进行了一系列的种子共生萌发实验，在1903年第一次指出兰科植物种子的萌发需要相应的真菌侵染[11]。

2.2植株与菌根真菌的研究

菌根真菌除了在兰科植物种子萌发阶段具有重要作用外，在幼苗阶段和成体阶段也十分关键。目前国内对于兰科植物种质资源的保护较多采用野生驯化以及迁地保护等措施。组织培养技术方法的扩展，在很大程度上解决了兰科植物种子萌发率低、繁殖速度慢的传统问题。然而将组培苗进行移栽后，幼苗的存活率和生长速度却不尽人意。大多数情况下，出瓶后的幼苗对环境不适应，在移栽后便枯死，或生长缓慢，难以达到预期的产量。因而对于兰科植物在幼苗和成体植株阶段生长发育机理的研究吸引了众多学者的关注。

为了更加深入地研究兰科植物与其内生真菌的相互关系和作用机理，研究者们做了大量的工作。首先在内生真菌的分离方法方面Bemard于1904年通过根组织表面消毒分离法成功分离到了兰科植物根中丝核菌样真菌，但是这种分离方法无法完全排除其他杂菌的污染，不仅增加了有用菌株筛选的工作量，同时也降低了实验结果的可靠性，因此Bemard又在1909年第1次通过单菌丝团分离的方法得到了兰科植物的菌根真菌，但此方法较为繁琐。在此之后Warcup等在单菌丝团分离方法的基础上又创立了更加完善的单菌丝团分离方法，相对于Bemard的方法更快速简捷[12]。尽管单菌丝团法已经发展的较为成熟，但是由于这种方法在处理根的表面附属物和杂菌的过程中有可能将有促生作用的菌株一并除去，降低了有益菌种筛选的完整性和可信度。除此之外，这种方法在单菌丝团分离操作中会增加杂菌的干扰几率。为了尽可能保证原始生境的所有有效菌株都能够被筛选出来，Rasmussen等[13]于1993年通过种子和根状茎套袋原生地播种诱捕法以及种子共生萌发技术，筛选出对兰科植物种子萌发有促进作用的菌根真菌，进一步提高了筛选促生真菌的准确性和简捷性。之后Brundrett等[14]又在Rasmussen的研究方法基础上，通过兰科植物种子非原生地播种诱捕菌根真菌的方法进一步提高了筛选工作的效率，这种方法避免了原位诱导筛选的复杂性，同时可以更加有效地分离到有用真菌。

通过上述方法筛选出有效的真菌后，这些真菌与兰科植物之间是如何实现互惠共生的，又是哪些物质在兰科植物的促生过程中起决定性作用，学者们在微观水平上也做了相应的工作。徐锦堂等[15]用拌菌播种的方法发现铁皮石斛种子的萌发率较野生条件有显著提高，并且进一步超微结构的观察说明：铁皮石斛胚细胞通过将菌丝消解成为片状并将分解得到的有用物质用于自身的营养繁殖。Senthilkumar等[16]采用生化分析的方法研究指出，Aeridesmaculosum在真菌的作用下根细胞内的消化酶的含量显著增加，从侧面反映出真菌的存在确实提高了兰科植物的代谢水平并促进了兰科植物的生长。张集慧等[17]在1999年用生理学方法鉴定并测量了5种内生真菌所产生的赤霉素(GA3)、吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)、玉米素(Z)、玉米素核苷(ZR)等5种植物激素的含量，结果表明真菌通过产生多种生长激素从而促进兰科植物种子的萌发。Harley[18]1983年通过生理方法得出真菌可以通过运转碳水化合物促进种子萌发，而且菌根真菌中有些通过分解土壤中的纤维素等多糖对种子的萌发起促生作用，入侵的真菌会释放抗生素等次生代谢产物使种子在萌发过程中免受致病菌的侵害，从而提高种子的萌发率。上述的拌菌播种、生理生化等方法不仅在微观水平上得到了真菌在兰科植物的生长繁殖过程中促生作用的部分证据，同时对后续微观水平的相关研究开拓了思路。

在菌根真菌对幼苗的促生研究中Zelmer等[19]发现一些兰科植物在其种子萌发阶段和成年兰阶段分别与不同种类的真菌形成共生关系。而Alexander和Hadley[20]的14C实验也同样表明对于有绿叶能进行光合作用的成体兰科植物幼苗来说，菌根结构对其生长发育仍是必不可少的。相关研究均表明，菌根真菌在兰科植物的全部生长过程中起到一定的促生作用，在成体苗的真菌促生机制研究中Read和Bidartondo[21]也采用原球茎套袋播种诱捕的方法对兰科属的Cephalanthera和Epipactis两种植物生长发育各个阶段的共生真菌进行了分子系统学的研究，并指出共生真菌种群在种子萌发阶段和成年兰阶段是变化的，是特定的共生真菌在特定的阶段通过其特定的促生机理完成其对植株的促生作用。

对于幼苗阶段的真菌对幼苗成长促生作用机理，研究者通过生理生化的方法也做了相应的辅证。1998年范黎等[22]指出，真菌是作为一种诱导因子从而激发了一系列细胞的生理生化反应，产生能够激活原球茎细胞内的贮存物分解的化学物质，使胞内储存物迅速分解从而起促生作用的，但未能阐明促进胞内储存物分解的机理。同时他们还发现，在经过具有菌根真菌侵染后的植株其根冠比明显低于空白对照组的值，由于根冠比的减小是与养分供应的增加成正比的，从而说明菌根真菌对宿主植物确实起到了促生的作用[23]。金辉等[24]发现接菌后幼苗的平均鲜重增长率、各矿质元素含量均高于未接菌的，微量元素含量的增加尤为明显，进一步得出了真菌对兰科植物的促生作用。同时研究发现，兰科植物菌根真菌可以侵染没有根的兰科植物的块茎和根茎，从而取代根的作用。对于有根的兰科植物来说菌根真菌可以通过入侵根毛和皮层来增强根的功能[25]，提高植物成活率[26]。

在研究菌根真菌与植物代谢产物方面，陈晓梅等[27]于2006年用灭活的真菌作为诱导子探究其对铁皮石斛代谢产物的影响，研究发现在铁皮石斛原球茎固体培养的后期加入真菌诱导子能促进原球茎的生长，并对总生物碱含量有一定的影响。兰科菌根真菌在入侵形成优势菌群后，释放的次生代谢产物中有些拮抗物质可以阻止其他病原菌侵入兰根，从而在很大程度上减轻了兰根遭受病害的威胁，并且间接提高了幼苗的成活率，促进了植株的生长。同时兰科植物也可能产生某些抑菌物质，抑制其他真菌的生长和繁殖，为菌根真菌创造更优越的共生环境，使自身更好地发挥作用[27]。

3 菌根的研究在生产中的应用

对菌根的不断研究还会促进微生物菌肥的研制。由于传统化肥的过度使用，大部分土地的肥力严重下降，土壤中的营养物质含量正在逐渐减少，因此发达国家已经在很大程度上限制了传统化肥的使用。而利用菌根技术开发出来的微生物菌肥能够改善土壤理化性状，提高土壤的肥力，改善农产品的品质等，更重要的是微生物菌肥的推广运用可以代替传统化肥的使用从而减少传统化肥对土壤环境乃至人类健康的危害，促进农业生产的可持续发展。因此，近些年我国已经将磷细菌、固氮菌及钾细菌同有机肥料混合制成的微生物菌肥作为新型肥料向华中、华北和西北等多地区逐步推广。

除了在微生物菌肥研制中的应用，菌根的研究同时促进了对菌剂的研发。由于菌根真菌具有促进植物的生长发育，增强宿主植物的抗病虫害能力，增强宿主植物的抗逆性及竞争能力，促进药用植物次生代谢产物的合成，促进植物修复和固氮等作用，目前一些发达国家已经将一些菌根真菌制成各种菌剂，如固体菌剂、液体菌剂、颗粒剂和丸剂等，并在农业生产实践中取得了较好的效果。由于我国的菌剂研究起步较晚，所以目前还未实现菌剂的商品化出售。

4 展 望

尽管在兰科菌根的研究方面学者们做了大量的工作，但是在诸多方面仍未研究清楚。例如兰科植物与真菌的专一性问题，真菌入侵的条件和机理，共代谢的机制，营养物质的转运和分配，共生系统的调控及活性成分分析等方面[28]。除此之外，在分离过程中，由于方法的不完善和某些菌株对营养物质的特殊需求可能会使一些对兰科植物有促生作用的真菌无法在实验条件下生长，因此无法被筛选出来。在真菌的鉴定方法上，由于真菌信息数据库的不完整给真菌的鉴定和分类带来了一定的困难。过去的研究基本证实了兰科植物与菌根真菌的关系，筛选到了几种兰科植物有效促生菌种，同时也初步地研究了菌根真菌对兰科植物的促生机制。但是对于兰科植物和菌根真菌之间更深层次的机理研究并不是很清楚，今后除了在菌根真菌的培养方法、分离鉴定方法和有效菌株的筛选方法上有所改进外，在菌根真菌对兰科植物促生机理的研究上应该更加深入。多运用最新的研究手段，从基因及其代谢物水平上对菌根真菌的促生机制进行研究，同时将这些成果应用于生产实践，从而解决兰科植物供不应求甚至濒临灭绝的困境。

由于菌根真菌与兰科植物在长期的共生过程中，两者间遗传漂变的存在使得兰科植物的部分基因会转化到菌根真菌的基因组中，使菌根真菌也具有产生兰科植物的药用活性成分的能力。所以对兰科植物控制药用活性物质分泌的基因的克隆以及控制其在微生物中有效的表达，将有可能实现通过微生物的发酵工程即可完成中药活性成分的生产。同时鉴于菌根研究对于农业生产中开发和利用微生物菌肥具有重要意义，今后的研究应该使微生物菌肥得到推广应用。

总之，随着对兰科植物菌根的共生和促生机制研究的不断深入以及将最新的研究成果不断向应用的转化，必将为社会生产的多个领域带来巨大的经济效益。

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SummarizationofResearchMethodofOrchidMycorrhizalFungi

ZHENG Chao-wen, XIAO Ya-ping

(Coll.ofLifeSci.,ShaanxiNormalUni.,Xi’an710062)

Resources of orchid family distribute widely over the globe. Many among them are important officinal and rare flower plants; they have drawn wide attention from all walks of life for their fairly high business values. Orchid plants have very low rate of reproduction in natural conditions because of their growing particularities; they could not meet wide market demand. Recent studies showed that almost plants of orchid family can establish symbiosis with corresponding mycorrhizal fungi, moreover, they must rely on these endophytic fungi they could complete their whole life history. Therefore study on the mechanism of mycorrhiza in the process to promote the growth rate and fertility of orchid plants and apply the research achievements to industrialized seedling will be the key to allay strained relationship between the supply and demand of orchid plants. In this paper research methods used in the issue betweenGastrodiaelataandDendrobiumofficinaleirecently were expounded, so as to provide certain references to the research on orchid mycorrhizal fungi.

orchid; mycorrhizal fungi; symbiotic mechanism; research method

大学生创新训练计划项目(cx13074)

郑超文 男，大学本科。研究方向为植物学。E-mail：121954782@qq.com

* 通讯作者。女，教授，硕士生导师。研究方向为植物学。E-mail：yapingxia@yahoo.com.cn

2014-02-04；

2014-02-27

Q93-31

A

1005-7021(2014)04-0085-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2014.04.017