邓平平 施永海 张根玉 张之文 张海明 陆根海 刘永士

（上海市水产研究所，上海 200433）

磁珠富集法分离刀鲚微卫星标记

邓平平 施永海 张根玉 张之文 张海明 陆根海 刘永士

（上海市水产研究所，上海 200433）

利用磁珠富集法分离微卫星序列，以开发长江刀鲚微卫星分子标记。将长江刀鲚基因组DNA经限制内切酶Mse I酶切，回收400-1 000 bp片段，安装接头，构建长江刀鲚全基因组PCR文库。用生物素标记的微卫星探针（CA）12与其杂交，磁珠富集含有微卫星序列的 DNA片段。将洗脱所得片段进行PCR扩增，然后进行克隆。经过菌落PCR检验后挑选出118个阳性克隆进行测序，其中97条含有微卫星序列。用设计合成59对微卫星引物对30尾养殖长江刀鲚进行引物的多态性筛选，得到9对多态性引物。

刀鲚 磁珠富集 微卫星 多态性

刀鲚（C. ectenes）隶属于鲱形目（Clupeiforms）鳀科（Engraulidae）鲚属（Coilia），是一种小型的洄游鳀科鱼类，主要分布在我国长江中下游及沿海河口流域，因其肉味鲜美有“长江三鲜”之首的美誉。由于长江流域自20世纪70年代以来受过度捕捞、水利工程修建、生活和工业污水的排放以及水运发展等因素的影响，刀鲚的生殖洄游通路被阻断，生活水环境被污染，长江刀鲚的产量和种群数量极具减少，难再形成渔汛。

刀鲚的研究早期集中在渔业资源［1，2］、年龄、生长［3］、胚胎发育和洄游［4］方面，后期开展了一系列同工酶［5］、线粒体基因（Dloop［6］、cytb［7］、16S rRNA［8］）、RAPD-PCR［9，10］和ISSR-PCR［10］技术对鳀科鱼类进行的遗传多样性和分类研究。目前刀鲚微卫星标记的开发和运用报道不多，仅限于Ma［11］和Chen［12］对此做过研究。本研究运用磁珠富集的方法筛选新的刀鲚微卫星分子标记，以期为刀鲚养殖品系的优化、遗传多样性的检测及遗传图谱构建提供更有效的研究工具。

1 材料与方法

1.1 材料

30尾长江刀鲚来自上海市水产研究所苗种技术中心养殖品种。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取 取长江刀鲚肌肉于无水乙醇中固定，-20℃保存。长江刀鲚基因组DNA提取采用传统的苯酚/氯仿法［13］，将获得的DNA溶

于灭菌的无菌水中，使用前需琼脂糖检测及紫外分光光度计定量，4℃下保存备用。

1.2.2 长江刀鲚基因组文库的构建

1.2.2.1 基因组DNA的酶切、回收及连接 在37℃水浴锅中使用限制性内切酶MseI将100 μg长江刀鲚基因组DNA酶切4 h，1%琼脂糖电泳后，切割回收400-1 000 bp大小的基因片段。取4 μL酶切产物，1 μL接头MA：5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3'（MA1和MA2混合产物），5 μL SolutionⅡ和10 μL SolutionⅠ在16℃连接过夜。

1.2.2.2 扩增接头连接的DNA片段 以酶切连接好的产物为模板，以MA：5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3'为引物进行扩增，PCR反应条件为：94℃变性5 min；94℃ 30 s，53℃ 1 min，72℃ 1 min，循环20次；72℃延伸5 min。取5 μL PCR产物进行琼脂糖电泳检测，判断扩增产物的分布范围以及产量。

1.2.3 微卫星序列的富集

1.2.3.1 杂交 根据预试验的摸索建立100 μL的反应体系，1 μL（100 μmol/L）探针（为BSSR-l：5'-bio-CACACACACACACACACACACACA-3'）、21 μL 20×SSC、0.7 μL 10% SDS、67.3 μL灭菌ddH2O。混合均匀后，95℃反应5 min，58℃放置15 min。在杂交中同时进行磁珠的平衡处理。

1.2.3.2 磁珠的处理 将磁珠溶液轻摇均匀，吸出100 μL移至1.5 mL离心管中，并加入1 mL TEN100，混匀清洗磁珠2 min后置于磁性分离架上约1 min，轻轻吸出透明液体，重复以上步骤至少两次，直至磁珠顺滑再加入40 μL TEN100，同时加入变性的质粒DNA以封闭磁珠表面。

1.2.3.3 磁珠吸附富集 将杂交产物与平衡封闭处理后的磁珠进行混合，加入300 μL TEN100，室温放置30 min，并轻摇混匀。

1.2.3.4 洗涤与洗脱 将磁珠富集的产物进行3次松弛性洗涤（使用TEN1000进行洗涤），再进行3次严谨性洗涤（使用0.2×SSC+0.1% SDS洗涤）。向洗涤好的磁珠中加入50 μL TE缓冲液，混匀并95℃加热10 min，在磁力架上迅速分离透明液体作为第一次洗脱液。再向磁珠中加入12 μL 0.15 mol/L的NaOH，轻柔混匀，用磁力架分离透明液体，并加入1.8 μL 1 mmol/L的HCl，加入36.2 μL TE使体积补足为50 μL，作为第二次洗脱液。先后分别回收二次洗脱产物以作备用。

1.2.3.5 洗脱产物的扩增及回收 分别以两次洗脱产物为模板，MA为引物，PCR程序为：94℃变性5 min；94℃ 30 s，53℃ 1 min，72℃ 1 min，30个循环；并在72℃延伸5 min。将两种PCR产物在1%琼脂糖中电泳，切下片段大小在400-1 000 bp的胶段，回收切割片段并在1%琼脂糖中电泳检测回收效率。

1.2.3.6 连接与转化 建立10 μL连接反应体系，1 μL pMD18-T（50 ng/μL）、插入片段2 μL、SolutionⅠ5 μL、2 μL ddH2O在16℃水浴连接4 h以制备充足质粒。在CaCl2制备的感受态大肠杆菌DH5α转化下，最终得到长江刀鲚微卫星文库。用载体通用引物M13（-47与-48）和SSR01对每个菌落进行3次PCR，挑选出阳性克隆送出测序。

1.2.4 微卫星序列引物设计及多态性引物筛选 运用常规引物设计技巧［14］对测出含有微卫星片段的序列利用Primer Premier 5.0设计59对引物，并对采取的30尾长江刀鲚样品进行引物多样性的筛选。

2 结果

2.1 酶切及其产物连接后PCR扩增

以长江刀鲚基因组DNA为底物进行MseI酶切，将酶切产物与接头连接，检测其PCR产物可见一片分布比较均匀的片段，片段的大小主要集中在300-1 000 bp（图1）。

图1 基因组酶切电泳图

2.2 菌落PCR检验重组率

在CaCl2制备的感受态大肠杆菌DH5α转化下，得到长江刀鲚基因组文库共800个克隆，挑选了其中的170个菌落进行菌落PCR检验，得到阳性克隆118个（阳性克隆率约为69.41%）。

2.3 测序结果

对挑选出的118个阳性克隆进行测序，有97个（82.81%）克隆含有微卫星片段，这97个含有微卫星的克隆中含有微卫星位点共计271个，其中以AC/TG为重复基元的微卫星序列最多为221个（81.55%），AG/CT次之为48个（17.71%）。重复次数在10-20间的68个（25.09%），最高重复次数为55次。其中完美型微卫星156个，非完美型44个，复合完美型12个（表1）。从测序结果发现，除了出现对应探针CA重复基元外，还获得了GA、TC、GAG、AAC和ACGC重复基元。已在GenBank登录92条（登录号：KF62219、KF682220、KF690275-KF690364）。

表1 长江刀鲚微卫星的不同类型所占比例

2.4 引物设计与筛选

在所测得的97条含有微卫星序列中，排除了不符合引物设计条件［14］的序列，利用引物设计软件Primer premier 5.0共设计59对引物，并以上海水产研究所养殖的30尾长江刀鲚基因组DNA为模板分别进行PCR扩增，其中有9对引物对本次采样表现出多态性，能够作为长江刀鲚微卫星分子标记。利用温度梯度PCR方法，摸索出这9对引物的最佳退火温度，具体信息列于表2。

表2 9对SSR引物对长江刀鲚多态性检测结果

3 讨论

3.1 开发微卫星分子标记的途径

随着分子标记技术的发展，微卫星分子标记在群体结构、遗传学分析、基因鉴定、生物多态性分析等方面逐渐展现出它的优势，而它的开发一度成为分子生物学领域的研究热点［15］。目前微开发卫星分子标记主要有2种途径：一种是对已经公布的序列数据作相应的处理或者直接借用，如对EMBL、GenBank和DDBJ［16］等DNA序列数据库检索出的微卫星片段进行引物设计和筛选获得微卫星分子标记，以及借用相邻品种已经开发出的微卫星分子标记。这种方法虽然简单且资金投入少，但是可检索的资源相对有限，特别是对于一些尚未开展相关研究的品种此法难易实施。另一种是先构建一个全基因文库，然后通过杂交筛选出需要的微卫星序列。因杂交的方式和探针的类别不同分为非放射性或放射性标记探针的Southern杂交与寡核苷酸探针的磁珠富集法。由于磁珠富集法具有效率高、人力和资金投入少以及耗时少等明显优势而被科研工作者普遍采用。本研究通过磁珠富集法得到长江刀鲚基因组文库共800个克隆，挑选了其中的170个菌落进行菌落PCR检验，得到阳性克隆118个，阳性克隆率约为69.41%。这比用经典的构建和筛选小插入片段基因组文库的方法［17，18］分离含微卫星序列的阳

性克隆率（1%-3%）要高出很多。

3.2 运用磁珠富集法需要注意的关键环节

虽然运用磁珠富集法筛选微卫星序列有诸多优势，但整个过程环节却不少，特别是关键环节的把握。如探针与连接产物的杂交、磁珠的平衡以及洗涤与洗脱，这些都关系到磁珠富集含有微卫星序列的效率。本试验严控以上几个关键点，使阳性克隆率达到69.41%，这优于大部分同类试验［19-24］，但比薛华柏［25］对小黄李的研究低。另外，由于磁珠富集环节较多，各环节间又相互依存，特别是相邻环节更要注意检测分析结果，以便更稳更快地开展试验。在酶切回收以及洗脱产物的扩增回收过程中，由于其他原因本试验没有采用低熔点胶而是采用常规琼脂糖胶，从最终的结果看还是可行的，但回收的效率不是很高。

3.3 多态性引物筛选时样本的选取问题

通过磁珠富集法获得了97条微卫星序列并以此设计了59对引物，以人工繁殖的30尾长江刀鲚为模板进行引物的行多态性筛选，最终只获得了9对多态性引物，且有6对引物表现出单态性，有10对引物没有扩增出产物，另外24对引物扩增的效果不理想。出现单态性引物偏多可能有两方面的原因：一是设计合成的引物对长江刀鲚这个品种只表现单态性，二是本试验所使用的样本是人工繁育群体，可能存在一定的近亲繁殖现象［26］。

4 结论

经过磁珠富集后，得到118个阳性克隆，其中97个阳性克隆含有微卫星序列。在获得含有微卫星序列的基础上设计合成59对引物，并对30尾养殖长江刀鲚进行引物的多态性筛选，最终得到9对多态性引物，为长江刀鲚的多样性分析提供一定的帮助。

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（责任编辑 马鑫）

Isolation of Microsatellite in C. ectenes by Magnetic Beads

Deng Pingping Shi Yonghai Zhang Genyu Zhang Zhiwen Zhang Haiming Lu Genhai Liu Yongshi
（Shanghai Fisheries Research Institute，Shanghai 200433）

It was a study to develop microsatellite markers with the method of microsatellite enrichment by magnetic beads. Genomic DNA of C. ectenes was digested with restriction enzyme Mse I. The fragments of 400-1 000 bp were recycled and ligated with relevant adaptors, then the “complete genome PCR library” was constructed. The PCR products were hybridized by a biotin-labeled Oligo probe（CA）12, the microsatellites were enriched with magnetic beads. The eluted fragments from magnetic beads were amplified and cloned into pMD18-T vector. 118 positive clones were screened with PCR method from 170 clones. After sequenced, 97 microsatellite sequences were found, 59 pairs of SSR primers were designed, and 9 pairs of primers were polymorphism within 30 cultured Chang Jiang C. ectenes.

C. ectenes Enrichment by magnetic beads Microsatellite Polymorphism

2013-09-27

上海市科委重点科技公关项目（11391901300），科技部与上海市共同重大任务科研专项（12dz1909302）

邓平平，男，助理工程师，研究方向：水产养殖和育种工作；E-mail：kokou365@sohu.com