刘志强 陈洁 邱高峰

（上海海洋大学 农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306）

中华绒螯蟹EsSox21b-like基因干扰载体的构建及原核表达制备dsRNA

刘志强 陈洁 邱高峰

（上海海洋大学 农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306）

Sox（SRY-related HMG-box）基因是一类重要的转录因子，在动物的性别分化与决定、器官的发生等方面具有重要的调控作用。旨在利用RNA干扰技术证实该基因的功能，将EsSox21b-like基因617 bp的片段克隆至含有两个T7启动子的L4440载体上，构建了EsSox21b-like-L4440干扰载体，将该重组载体转化至RNaseⅢ缺陷型的HT115菌株中，经IPTG诱导菌株体内转录，获得了EsSox21b-like正义和反义单链RNA，经过变性、退火形成大量双链RNA（EsSox21b-like-dsRNA），能满足以后应用RNA干扰试验对于EsSox21b-like基因功能的研究。

中华绒螯蟹 RNA干扰 L4440 HT115 原核表达 dsRNA

1990年，Sinclair等［1］克隆获得人类Y 染色体上的性别决定基因 SRY（Sex-determining region of Y chromosome，SRY）。随后其他研究者在哺乳类、鸟类、爬行类、鱼类、节肢动物等物种［2-7］克隆获得了许多与SRY基因同源的基因，被命名为Sox基因（SRY-related HMG-box gene）［8］。不同物种的Sox基因编码的蛋白质均具有一个保守的HMG盒［9］，能与特定DNA序列相结合，调控特定基因的转录。亦已证明，Sox基因作为一种转录调控因子，在动物性别决定、神经系统的发育、软骨的发生、胸腺细

胞的发育、肿瘤细胞的发生等方面具有重要的调控作用［10，11］。之前，我们从中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）分离鉴定了一个只在性腺中特异性表达的EsSox21b-like基因［12］，推测该基因可能在中华绒螯蟹性腺分化与发育过程中发挥作用。

RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术是一种高效、特异性沉默同源mRNA的敲减工具，可阻断靶基因表达［13］，是研究基因功能［14］的有效方法，而获得能使目的RNA降解的dsRNA是实施RNA干扰技术的前提［15］。目前合成dsRNA主要是通过商业试剂盒体外转录合成或者利用原核体内转录合成两种方式［16，17］。利用商业试剂盒合成dsRNA成本高、合成量小，所以该方法合成的dsRNA多用于线虫、果蝇等一些小的模式生物的研究。对于一些经济价值高、个体大的物种来说，要导入大量的dsRNA才能起到一定的干扰效果，因此，商业试剂盒合成dsRNA不能满足这些物种科研或生产的需要。与利用商业转录试剂盒相比，原核体内转录合成dsRNA的方式经济高效。目前，通过该方法获得的dsRNA已被成功运用于果蝇、线虫、昆虫等一些生物的基因功能研究中［18-24］，而在水产物种中仅有对虾［25］等少数物种的基因功能研究使用了原核体内转录获得的dsRNA。本研究将中华绒螯蟹EsSox21b-like基因617 bp的片段插入至L4440载体的两个T7启动子之间，构建EsSox21b-like-L4440干扰载体（图1）。将该重组载体转化至RNaseⅢ缺陷性的HT115菌株中，经IPTG诱导，菌株体内转录EsSox21b-like基因正义链和反义链RNA，经过变性、退火获得EsSox21b-like-dsRNA，旨在为以后利用RNA干扰技术研究EsSox21b-like基因的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

中华绒螯蟹购自上海临港新城果园农贸市场，用于提取卵巢的RNA；载体L4440与菌株HT115为美国线虫遗传中心馈赠。

1.2 方法

1.2.1 卵巢RNA提取及cDNA第一链的合成 根据RNAiso Plus（TaKaRa，Japan）说明书提供的操作步骤提取中华绒螯蟹卵巢RNA。提取的RNA经DNA酶处理去除DNA的污染后，利用反转录试剂盒（上海天根生物技术公司）合成cDNA第一链。

图1 干扰载体构建流程

1.2.2 RNA干扰片段的选定与引物设计 利用si-RNA在线分析软件对中华绒螯蟹的EsSox21b-like基因进行分析，并结合基因结构域和保守位点选取有效的干扰片段。根据对选择的617 bp的靶序列片段和L4440质粒的酶切位点进行分析设计引物。引物序列：EsSox21b-likeF：5'-tccccgcggTGCCACCAAGAAGGAGGAC-3'；EsSox21b-likeR：5'-ggactagtGCAAGGACGACGCTGACT-3'。利用设计的引物和反转录获得的cDNA第一链为模板进行PCR反应，获得目的片段。

1.2.3 重组体的构建 PCR获得的目的片段和L4440载体用限制性内切酶SpeI和SacII（Promega）进行双酶切。酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳和割胶纯化后连接过夜。

1.2.4 阳性克隆的筛选 将重组载体L4440+EsSox-21b-like转化大肠杆菌HT115感受态，然后涂布到选择性固体培养基培养。通过菌落PCR、双酶切筛选阳性克隆，并将筛选的菌液送测序公司（美吉测序，上海）测序。

1.2.5 dsRNA的合成 将测序正确的含L4440+Sox重组质粒的HT115菌株，接种到4 mL含氨苄和四环素的液体LB培养基上过夜扩大培养。分别取300

μL扩大培养的菌株接种到30 mL的2×YT培养基上，37℃震荡培养至OD595=0.5左右，加入57.6 μL（50 mg/mL）的IPTG诱导，继续培养5 h左右。

利用Trizol法提取诱导后培养菌株的RNA，提取的RNA经琼脂糖电泳检测其完整性。用RQ1 RNase-Free DNase处理，去除可能混有的DNA，然后72℃水浴变性10 min，自然冷却至室温，退火形成dsRNA。加RNaseA检验退火是否得到dsRNA。通过琼脂糖电泳和分光光度计对得到的dsRNA进行检测和浓度测定。

2 结果

2.1 重组载体的构建

提取的中华绒螯蟹卵巢RNA经RQ1 RNase-Free DNase去除DNA的干扰。利用反转录试剂盒合成cDNA的第一链，以cDNA的第一链为模板，F1和R1为引物PCR克隆获得EsSox21b-like基因的部分片段。如图2-A可知，获得的目的片段与预期的片段大小（617 bp）吻合。利用限制性内切酶SpeI和SacII对PCR产物和载体L4440进行双酶切，电泳检测酶切效果如图2-B所示。

图2 EsSox21b-like基因PCR产物（A）及目的片段和L4440双酶切验证（B）

2.2 阳性菌落的筛选

如图3-A所示，用T7单引物（5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'）对在选择性培养基上长出的菌落进行筛选时，得到其菌落PCR产物，包括插入的617 bp的目的片段和质粒L4440两个T7启动子之间的部分序列，其大小约为800 bp；而对L4440空质粒进行的PCR仅仅扩增质粒L4440两个T7启动子之间的序列，产物大小约为200 bp。经过对重组质粒用SpeI和SacII进行双酶切后获得了与目的片段大小（617 bp）一样的酶切片段（图3-B）。进一步对选择性培养基上长出的菌落进行测序，结果和目的序列也完全吻合，说明目的片段已成功地插入到载体L4440上。

图3 重组载体菌落PCR（A）及双酶切（B）检测

2.3 原核表达制备EsSox21b-like-dsRNA

提取经过IPTG诱导后和未经诱导的菌株的RNA，经过琼脂糖凝胶电泳检测发现，与未经IPTG诱导的菌株RNA相比，经过IPTG诱导的菌株的RNA包括转录的600 bp的目的片段和质粒L4440两个T7启动子之间的部分序列，大小约为800 bp（图4-A）。经过RQ1 RNase- Free DNase处理、72℃水浴变性、然后退火冷却至室温，最后经RNase处理该条带仍清晰可见（图4-B）。经分光光度计测定，溶解于100 μL去离子水中的dsRNA浓度为5 837

μg/mL。

图4 原核表达制备的EsSox21b-like-dsRNA

3 讨论

dsRNA的制备是实施RNA干扰试验的条件，一种操作简单，低成本制备dsRNA的方法可以便于RNAi在相关研究中的应用。目前常用制备dsRNA的方法有2种，体外转录法和体内载体表达法。与利用商业试剂盒体外转录相比，细菌体内载体表达可以经济高效的制备dsRNA。可是，构建干扰表达载体通常需要3步克隆实现［26］，虽然在研究斑节对虾kazal型蛋白激酶抑制剂基因功能时，梁艳等［25］利用商业载体pGMT和pGRIVE通过2步克隆的方式成功的构建了干扰表达载体，但多步克隆带来的繁琐操作依然不可避免。L4440具有两个T7启动子［27］，只需一步克隆，将目的片段插入到两个启动子之间就可成功的构建出干扰表达载体。并且，L4440具有两个相同的启动子，因此，在IPTG诱导时能转录获得几乎等量的正义链和反义链的RNA，从而使得在变性退火时有足够的正义或反义链RNA与其互补链退火形成dsRNA。

正义和反义链RNA的浓度对变性退火制备dsRNA时有非常重要的影响，当对低浓度的正义链和反义链RNA进行处理时很难获得dsRNA或者获得的量很低，当增加正义链和反义链RNA的浓度时便能高效地获得dsRNA。这可能是由于经过变性处理的低浓度的正义链和反义链RNA，在还未“寻找”到与之互补的RNA链时便自身发生链内互补序列的退火结合，高浓度的RNA在退火时与互补链RNA结合的概率要高于自身互补结合的概率。HT115菌株是一种RNaseIII缺陷型菌株，因此通过诱导表达的EsSox21b-like基因片段的RNA不会被降解，能够大量保存下来，这就在浓度上保证了变性后的RNA能够顺利地互补结合形成dsRNA。另外，合理地选择培养基也能够有效地提高正义链和反义链RNA的浓度。试验开始时选用加氨苄青霉素的2×YT培养基，诱导表达后，正义链和反义链RNA浓度很低。改用不加氨苄青霉素的2×YT培养基后，经过诱导，能够获得高浓度的正义链和反义链RNA。这可能是由于加入抗生素后，细菌要把更多的物质和能量用于合成适应氨苄青霉素环境的物质，而影响了转录合成目的基因正义链和反义链RNA。

本试验通过原核体内转录的方式仅需要培养30 mL的菌株便能获得约0.5 mg/次的EsSox21blike-dsRNA，而商业转录试剂盒合成dsRNA时，最高产量为0.03 mg/次（RiboMAXTMLarge Scale RNA Production Systems—SP6 and T7使用说明书）。可见利用本试验方法能高效获得dsRNA，仅需花费少量的资金和时间即能合成足量的EsSox21b-like-dsRNA用于研究EsSox21b-like基因的功能。

4 结论

将中华绒螯蟹EsSox21b-like基因617 bp的目的片段克隆至L4440载体上，构建了能够在原核体内转录出目的片段正义链和反义链RNA的干扰表达载体，并且通过对获得的目的片段正义链和反义链RNA进行变性、退火处理，制备了可用于以后RNA干扰试验的EsSox21b-like-dsRNA。

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（责任编辑 马鑫）

Construction of Interference Vector of EsSox21b-like Gene from Chinese Mitten Crab（Eriocheir sinensis）and Preparation of dsRNA by Prokaryotic Expression

Liu Zhiqiang Chen Jie Qiu Gaofeng
（Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources，Ministry of Agriculture，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）

Sox（SRY-related HMG-box）gene is a kind of important transcription factor, which functions in sex determination, organogenesis, etc. The gonad-specific expression of this novel gene suggested that it might play an important role in the development of gonad. To determine the exact role of EsSox21b-like gene using RNA interference, a EsSox21b-like-L4440 interference vector was successfully constructed for production of large amount of dsRNA. The target sequence of EsSox21b-like gene was inserted into the L4440 vector containing two T7 promoters. Then the recombinant plasmid was transformed into HT115 bacteria, a RNaseⅢ deficient strain. A large amount of EsSox21blike sense and antisense RNAs was simultaneously transcripted in vivo when induced by IPTG. After denatured and annealed, EsSox21b-like double strand RNAs（dsRNAs）were produced and the yield of EsSox21b-like-dsRNA was enough for future RNA interference experiment on the role of EsSox21b-like gene.

Eriocheir sinensis RNA interference L4440 HT115 Prokaryotic expression dsRNA

2013-11-06

国家自然科学基金项目（31272655），国家科技支撑计划项目（2012BAD26B04），上海市科委基础重点科研项目（11JC1404600），上海高校水产学一流学科建设项目（B5005120001）

刘志强，男，硕士，研究方向：中华绒螯蟹生殖与发育；E-mail：liu503212225@sohu.com

邱高峰，男，教授，博士生导师，研究方向：虾蟹分子遗传与繁殖；E-mail：gfqiu@shou.edu.cn