王 森 高 敏 赵 毅 朱 伟 姜恩平 康海仙 姚运红 胡新荣

1.广东医学院肿瘤研究所病理教研室，广东广州523808；2.广东省东莞市人民医院病理科，广东东莞523059

RNA干扰HPV E6下调eIF4E转录表达抑制宫颈癌Hela细胞增殖并影响细胞周期进程研究

王 森1高 敏2赵 毅1朱 伟1姜恩平1康海仙1姚运红1胡新荣1

1.广东医学院肿瘤研究所病理教研室，广东广州523808；2.广东省东莞市人民医院病理科，广东东莞523059

目的探讨宫颈癌Hella细胞中干扰HPV E6对eIF4E表达的调控，探寻HPV E6促癌的新途径，为宫颈癌诊断和治疗提供新靶点。方法构建高效的靶向HPV18 E6的shRNA质粒（shE6）并测序，而后转染人宫颈癌Hela细胞，荧光显微镜及流式细胞术检测转染效率。而后以Real-time PCR检测E6及eIF4E的mRNA水平，采用CCK-8法检测Hela细胞增殖能力的改变，流式细胞术检测细胞周期。结果测序结果显示成功构建shE6质粒。shE6-3转染人宫颈癌Hela细胞后48 h，E6及eIF4E mRNA表达的抑制率分别约为80%，76%。shE6-3对Hela细胞的增殖活性在48 h的抑制效果最明显，增殖抑制率约为21%；相对于NC组，shE6组G0/G1期细胞比例显著增高，而S期比例减少，G2/M期未见明显变化。结论RNA干扰HPV E6能够下调eIF4E转录表达，抑制宫颈癌Hela细胞增殖，并阻滞细胞周期于G0/G1期。eIF4E有望成为宫颈癌防治的潜在靶点。

宫颈癌；E6；真核细胞翻译起始因子；RNA干扰

真核细胞翻译起始因子4E（eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E）是新近发现的原癌基因，与肿瘤的发生发展密切相关。eIF4E是帽依赖性翻译起始必需的且起限速作用的翻译启始因子，被认为是控制真核细胞翻译的主要开关之一。人eIF4E基因定位于染色体4q21～q25，编码24 kD的多肽。尽管eIF4E在控制细胞增殖和转化的蛋白翻译的作用已被证实，其表达调控至今不明，特别是在特定肿瘤如鼻咽癌、宫颈癌等病毒密切相关肿瘤中的调节机制有待更深入研究。目前，eIF4E与宫颈癌关系的研究尚处于起步阶段。国内尚未见宫颈癌中调控eIF4E表达的报道。本研究利用RNA干扰技术探讨了HPV E6对eIF4E转录表达的调控作用，有助于阐明eIF4E及E6致癌的机制，为宫颈癌诊断和治疗提供新靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 基本材料CCK-8试剂盒购自上海生工，脂质体Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，胎牛血清及DMEM培养基购自Gibco公司，eIF4E抗体购自Santacruz。

1.1.2 细胞本研究采用HPV+的宫颈癌Hella细胞。细胞培养于37℃，5%CO2培养箱中，使用标准培养基（RPMI 1640）。

1.1.3 质粒E6的shRNA干扰质粒（shE6）由上海吉凯公司构建完成。其中，三对shRNA框架序列分别为E6-shRNA-1（stem：CCTACAAGCTACCTGATCT，loop：AGTGAAGCCACAGATGTA，stem：AGATCAGGTAGCTTGTA GG），E6-shRNA-2（stem：GGAACTTACAGAGGT ATTT，Loop：AGTGAAGCCACAGATGTA，stem：AAATA CCTCTG TAAGTTCC），E6-shRNA-3（stem：GCAGAGAAACACAAGTATA，loop：AGTGAAGCCACAGATGTA，stem：TATACTTGTGTTTCTCTGC）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组实验分为三组：MOCK组（即：未处理Hela细胞组），NC组（即：空白质粒组），shE6组（即：shRNA干扰E6组，包括E6的三种干扰质粒shE6-1、shE6-2、shE6-3）。

1.2.2 qRT-PCR检测宫颈癌细胞HPV E6及e IF4E mRNA表达HPV18 E6、eIF4E及GAPDH引物由长沙艾杰生物技术有限公司设计并合成。HPV18 E6引物序列为：forward5′-CGAACCGTTGAATCCAGCAGAA-3′，reverse5′-CGAACCGTTGAATCCAGCAGAA-3′。eIF4E引物序列为：forward5′-CTGCGGCTGATCTCCAAG-3′，reverse5′-CTGCGGCTGATCTCCAAG-3′。GAPDH引物序列为：forward5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTT-3′，reverse5′-CCTGGAAGATGGTGATG GGATT-3′。RT-PCR反应中每20微升反应体系加1μL模板DNA，其反应条件设定如下：95℃，1min，95℃，30 s，30循环，54℃，30 s，72℃，7 min。

1.2.3 CCK-8法检测细胞增殖对数生长期细胞以RPMI-1640培养基调整密度为2.5×104/mL，100μL/孔接种于96孔板，每孔加入10μL CCK-8溶液继续孵育2 h，全自动酶标议上测吸光度值。细胞生长抑制率=（1-实验组吸光度值／对照组吸光度值）×100%。

1.2.4 流式细胞术检测细胞周期已处理细胞培养24、48、72 h后，0.25%胰酶消化1 min，加等量培养基终止反应后1500 r/min离心5min，弃上清，PBS洗2次后70%预冷乙醇固定，4℃保存过夜。上机前离心去除乙醇，冷PBS洗2遍，将细胞重悬于0.2 m L冷PBS中，加0.6 mL PI，4℃避光染色30min。400目尼龙网过滤后使用流式细胞仪检测。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 13.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间差异采用单因素方差分析，采用t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 E6-shRNA质粒有效干扰宫颈癌Hela细胞E6 mRNA的表达

本研究构建了靶向E6的shRNA质粒，命名为shE6（图1）。然后，将shE6转染人宫颈癌Hela细胞，观察转染12、24、36、48 h的细胞，倒置荧光显微镜下可见细胞中有绿色荧光表达，说明转染成功，可进行转染后操作（图2，见封三）。流式细胞术检测细胞内GFP表达，在转染shE6 24、48 h后，shE6组GFP表达率分别为17.2%、41.6%（图3），较对照组差异均有高度统计学意义（P＜0.01）；表明Lipofectamine TM 2000能有效将shE6转染入宫颈癌Hela细胞中。

2.2 沉默E6后Hela细胞eIF4E的表达相应下调

ShE6转染人宫颈癌细胞48 h后，NC与MOCK组相比，E6mRNA的表达水平基本一致，差异无统计学意义（P＞0.05），shE6-1～3均有明显的干扰作用，其中以shE6-3组抑制效率最高，抑制率约为80%（P＜0.001）（图4 A）。Real-Time PCR结果表明，shE6作用Hela细胞48 h后，NC组与MOCK组相比，eIF4E mRNA的表达水平基本一致，差异无统计学意义（P＞0.05）；shE6-1～3作用48 h后对eIF4EmRNA的表达均有明显的干扰作用，差异有统计学意义（P＜0.05），其中以shE6-3对eIF4E mRNA的表达抑制效率最高，抑制率约为76%（P＜0.001）（图4 B）。

2.3 高效shE6抑制了宫颈癌Hela细胞的增殖及细胞周期进程

采用CCK-8法检测转染后24、48、72 h后对Hela细胞的增殖活性的影响，结果发现转染shE6-3后能明显抑制Hela细胞的增殖，差异有统计学意义（P＜0.01）（图5）。

收集细胞进行流式细胞术检测，结果见表1，相对于MOCK组，NC组细胞各周期无明显变化（P＞0.05）。而转染shE6-3后，相对于MOCK组，细胞G0/G1期比例明显增加；G2/M期比例无明显变化（P＞0.05）。提示，转染shE6-3作用于Hela细胞后使细胞DNA合成下降（S期细胞分布比例降低），细胞生长停滞于G0/G1期，抑制Hela细胞的增殖。

图1 sh E6测序结果显示质粒构建正确

图3 流式细胞仪下shE6转染后GFP表达

图4 shE6转染Hela细胞导致E6及e IF4Em RNA表达下降

图5 shE6-3对Hela细胞增殖的影响

表1 shE6-3转染后Hela细胞的周期百分比分布（%）

3 讨论

eIF4E是新近发现的原癌基因，与肿瘤的发生发展密切相关[1-3]。eIF4E又称帽结合蛋白，能特异识别mRNA的帽结构，调控mRNA翻译的诸多关键步骤，如在细胞质中参与mRNA向43s起始复合物的转运以形成48s复合物，并帮助解开mRNA 5，非翻译区的二级结构等。在细胞核内eIF4E则选择性转运特殊mRNA，如VEGF、cyclinD1和ODC到细胞质而不影响看家基因mRNA。研究发现，eIF4E在宫颈癌癌、头颈部鳞癌等多种肿瘤细胞中过表达，并且与其发生、浸润、转移密切相关[4-5]。肿瘤细胞中过表达的eIF4E能打开长而高度结构化的5UTRs序列，大大提高了弱mRNA的表达，产生促进细胞生长和转化及血管生成的调节蛋白如c-myc、p53、cyclinD1、TGF-β、VEGF、MMP9、Bcl-2等参与癌的形成和转移[6-10]。然而，尽管eIF4E在控制细胞增殖和转化的蛋白翻译的作用已被证实，其表达调控至今不明，特别是在特定肿瘤如鼻咽癌、宫颈癌等病毒密切相关肿瘤中的调节机制有待更深入研究。

目前，eIF4E与宫颈癌关系的研究尚处于起步阶段。Van Tranppen等[11]应用RT-PCR方法在宫颈癌组织中检测到eIF4E的高表达，据此推断eIF4E参与了宫颈癌的发生并对疾病的发展产生重要影响。Lee等[12]应用免疫组化法发现在90%正常宫颈鳞状上皮组织中未检测到eIF4E的表达，随着宫颈上皮病变级别的升高，eIF4E表达逐渐增强。他们推断eIF4E的表达是宫颈癌变的早期改变，可能与正常宫颈上皮的恶性转化有关。然而，上述研究多局限于初步探索，迄今为止，eIF4E与宫颈癌关系的研究仍然极少，且eIF4E在宫颈癌中高表达的机制尚不清楚。

宫颈癌发病率居女性恶性肿瘤的第2位，仅次于乳腺癌。尽管其具体发病机制尚不清楚，然而已有研究表明，HPV感染是引起宫颈癌及其癌前病变的必要因素，几乎所有的宫颈癌组织均可检测到HPVDNA[13-14]。其中，HPV表达的E6蛋白是其最重要的致癌分子之一。该蛋白由151个氨基酸残基组成，含有2个锌指结构，每个锌指结构含有2个C-X-X-C序列。E6是高危型HPV的一个重要的致癌基因，它在致癌过程中的发挥了重要作用，可通过直接或间接途径与各种靶蛋白相互作用，如通过抑制P53和PDZ蛋白家族的活性，以及增强端粒酶的活性等致癌[15-16]。综合上述背景本研究推测宫颈癌中eIF4E高表达也极有可能源于HPV E6等源头癌基因的活化作用。目前未见宫颈癌源头癌基因如E6等对eIF4E表达调控的研究及eIF4E对宫颈癌细胞水平的作用报道。本研究探讨了HPV E6对eIF4E转录表达的调控作用，有助于阐明eIF4E在宫颈癌中过表达及E6致癌的新机制，为宫颈癌诊断和治疗提供新靶点。本研究提示，E6能够通过增强eIF4E基因表达而促进宫颈癌细胞增殖、细胞周期进程和迁移，抑制凋亡。研究表明，E6通过一系列复杂机制调控众多癌基因的蛋白表达发挥最终效应。而eIF4E属于帽式翻译限速因子，eIF4E的活化直接促进相关癌基因的mRNA翻译，这使得E6通过作用于eIF4E发挥促癌功能成为有效且便捷的途径。然而，迄今为止，尚极少有eIF4E对宫颈癌细胞生物学影响的报道。本研究将E6转染HPV-宫颈癌细胞后发现eIF4E表达随之升高，细胞增殖加快且凋亡减少。抑制HPV阳性肿瘤细胞中eIF4E表达的表达则表现出细胞增殖抑制且细胞周期阻滞等特点，这些结果提示eIF4E很可能参与了HPV致癌、促癌的主要环节。因此，eIF4E可能是HPV致癌关键节点，是宫颈癌防治的潜在靶点。

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Study of RNA interference of HPV E6 down regulates the transcripiton of eIF4E and inhibits the cell proliferation and cell cycle of Hela cells

WANG Sen1GAOMin2ZHAO Yi1ZHUWei1JIANG Enping1KANG Haixian1YAO Yunhong1HU Xinrong1
1.Departmentof Cancer Institute and Pathology,Guangdong Medical College,Guangdong Province,Guangzhou 523808, China;2.Department of Pathology,the People′s Hospital of Dongguan,Guangdong Province,Dongguan 523059,China

Ob jective To investigate RNA interference of E6 could regulate eIF4E in cervical cancer cells and to find new target gene for the diagnosis and therapy of cervical cancer.Methods ShRNAs of E6 were constructed by company and transfected into Hela cells.The transfection rate was detected by fluorescence microscope and flowcytometry (FCM).Real time PCR was used to detected mRNA of E6 and eIF4E.CCK-8 was employed for cell proliferation and FCM was used to detected the cell cycle.Resu lts ShRNA plasmids of E6 were constructed successfully and transfected into Hela cells.48 h later,themRNA of E6 and eIF4E were 80%,76%,respectively.ShE6-3 leaded to the inhibition of cell proliferation(21%)at 48 h.In the cell cyle detection,the cells of G0/G1phase increased highly while the cells of S phase decreased.The cells of G2/M phase was the same to that of the control group.Conclusion ShE6 can inhibit the cell proliferatin of cervical cancer and can down regulate the transcription of eIF4E,block the cell cycle on G0/G1, whichmightbe a potenitial target for cervical cancer.

Cervical cancer;E6;Eukaryotic cells and translation initiation;RNA interference

R737.33

A

1673-7210（2014）01（b）-0004-04

2013-11-15本文编辑：卫轲）

国家自然科学基金项目（编号81302244）；广东省自然科学基金面上项目（编号S2012040006383）；广东省医学基金立项课题（编号B2013293）；广东省高等学校科技创新（重点）项目（编号2012KJCX0057）。

王森（1983.1-），男，博士；研究方向：肿瘤病理学与肿瘤分子生物学。

胡新荣（1962.8-），男，博士，教授，博士生导师；研究方向：肿瘤病理学与肿瘤分子生物学。