李国慧，刘瑞花，李贵霞，张丽霞，张素领

(1.河北省儿童医院检验科，河北 石家庄 050031;2.河北省老年病医院药剂科，河北 石家庄 050011)

骨肉瘤是儿童和青少年常见的骨恶性肿瘤,尽管早期手术和辅助化疗使得患者预后有明显的改善,但目前仍有20%～40%患者死于远端转移,对于远端转移的患者,采用化疗是惟一有效的治疗方法,新辅助化疗对提高骨肉瘤患者的5年生存率至关重要。相对于其他恶性肿瘤，治疗骨肉瘤的化疗药物种类不多，而且目前供临床使用的化疗药物效果都不太理想,因此筛选不良反应小、治疗疗效高的抗癌药物,已成为当前热门研究的课题。本研究运用电镜技术和流式细胞术探讨苦参碱对人骨肉瘤细胞MG63诱导凋亡效应，并对促凋亡因子caspase-3产生量的变化进行检测和分析，旨在进一步阐明苦参碱抗癌的作用机制，为临床使用苦参碱抗癌治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养：人骨肉瘤MG63细胞株由河北医科大学第三医院实验中心保存，提供使用。

MG63细胞生长在含10%胎牛血清的DMEM培养基37℃饱和湿度5%CO2培养箱中培养。待细胞进入对数生长期后用于实验。

1.2 透射电镜观察：当MG63细胞生长到80%汇合时，加入终浓度为0.2、0.4、0.6g/L含苦参碱的培养基，对照组加入不含苦参碱药物的培养基，用药物培养作用72h后，收集细胞，用PBS洗2次，然后用体积分数2.5% 的戊二醛4℃固定2h，经PBS洗涤2次；用10g/L锇酸后固定，经PBS洗涤2次；丙酮系列脱水；最后用Epon812环氧树脂包埋。KB-1型超薄切片机切片；醋酸铀与柠檬酸铅双重染色；在透射电镜(日立H-7500，日本)下观察并照相。

1.3 流式细胞术检测细胞凋亡：收集经苦参碱作用72h的MG63细胞和对照组细胞，冷PBS漂洗3次。预冷70%乙醇4℃冰箱固定，上机检测前离心去固定液，0.5%胃蛋白酶消化，碘化丙锭(50mg/L Trinton X-100 1.0%)室温避光染色，流式细胞仪上机检测，应用软件进行分析。

1.4 流式细胞术检测caspase-3蛋白的表达：收集经苦参碱作用72h的MG63细胞及对照组细胞，按常规方法进行荧光标记，流式细胞仪检测荧光强度，以荧光指数表示蛋白的表达情况。

2 结 果

2.1 电镜观察结果：电镜下可见对照组MG63细胞表面有少许微绒毛，细胞体积较大，椭圆形，核大，不规则，细胞质内有线粒体，粗面内质网，还有游离的核糖体(图1A)。0.6g/L苦参碱干预MG63细胞72h后，电镜下可观察到瘤细胞体积变小，细胞表面微绒毛消失，细胞核染色质凝集边聚，粗面内质网肿胀，细胞表面出现空泡(图1B)。

图1 透射电镜观察结果

A.对照组细胞(×15 000)；B.0.6g/L苦参碱干预72h后的MG63细胞(×15 000)

Figure 1 Morphological observation by transmission electron microscopy in MG63 cells

A.Control cells(×15 000); B.Cells treated with 0.6g/L of matrine for 72h(×15 000)

2.2 细胞凋亡情况：0.2、0.4、0.6g/L的苦参碱处理细胞72h后，G0/G1期前面出现凋亡峰。MG63细胞凋亡率分别为(11.37±0.53)%、(14.28%±0.16)%、(24.59±0.23)%，与对照组细胞的凋亡率(3.27±0.11)%比较差异有统计学意义(P<0.01)。处理后各作用组的细胞G0/G1期比例增高，分别为(69.14±1.12)%、(75.31±0.33)%、(82.64±0.16)%，与对照组的(63.21±1.52)%比较差异有统计学意义(P<0.01)。

2.3 Caspase-3蛋白表达情况：0.2、0.4、0.6g/L苦参碱处理细胞72h后，caspase-3蛋白表达升高，MG63细胞的荧光指数分别为1.64±0.01、1.84±0.03、2.08±0.02，与对照组细胞荧光指数1.00±0.02比较差异有统计学意义(P<0.01)。

3 讨 论

当前恶性肿瘤的发病率逐年增加，已经成为严重威胁人类健康的一大杀手，对恶性肿瘤的防治成为医务工作者面临的重要课题。目前抗癌药物的研究已逐渐转向天然动植物，我国传统的中医中药越来越受到人们的青睐。苦参碱是从中药苦参的干燥根中提取的一类活性物质，多年来的药理和临床研究发现苦参碱毒性小，具有抗病毒、抗炎、抗肝纤维化、保肝降酶、升高白细胞、强心、降压、抗心率失常、提高机体免疫力等作用[1-2]，特别是抗癌作用的发现，引起了人们的普遍关注[3-4]。苦参碱治疗骨肉瘤的研究尚处于起步阶段。

肿瘤发生不仅是由于瘤细胞的过度增生，还与瘤细胞死亡过少、凋亡机制障碍有关[5]。细胞凋亡参与肿瘤起始过程，并对肿瘤发生发展起负调控作用[6]。本研究结果显示，MG63细胞在经苦参碱作用后，电镜下呈早期凋亡的特征，细胞膜微绒毛消失，可见出芽现象，细胞质浓缩，细胞核染色质凝集边聚，最终细胞核崩解为碎片，并连同其周围的胞浆共同形成许多凋亡小体。本研究流式细胞术分析显示，与对照组相比，随着苦参碱药物浓度的增加，G0/G1期占细胞周期的比例逐渐增加，同时发现苦参碱组细胞G1期前面出现亚二倍体的凋亡峰，0.2、0.4、0.6g/L的苦参碱作用细胞72h后，MG63细胞凋亡率分别为(11.37±0.53)%、(14.28±0.16)%、(24.59±0.23)%，呈递增趋势。表明苦参碱能显著抑制骨肉瘤MG63细胞的增殖，在阻滞细胞周期进程的同时诱导细胞发生凋亡。

Caspase家族在细胞凋亡中具有重要作用，其中caspase-3最为关键，在正常情况下caspase-3以无活性的形式存在于细胞质，当细胞发生凋亡时则转化为有活性的caspase-3。现已发现一些药物诱导的肿瘤细胞凋亡中有caspase-3的活化[7-11]。本研究利用流式细胞技术观察到经不同浓度苦参碱作用的MG63细胞中caspase-3蛋白逐渐升高。说明苦参碱作用MG63细胞过程中有caspase-3的活化，所以使苦参碱诱导MG63细胞的凋亡率增加。表明苦参碱诱导MG63细胞凋亡作用可能与促进caspase-3基因的表达活性增加有关。苦参碱调控caspase-3基因表达的分子生物学机制尚有待进一步研究证实。

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