王春艳，阎斌伦

（淮海工学院江苏省海洋生物技术重点实验室，江苏连云港 222005）

0 引言

抗生素抗药基因作为一种新型环境污染物受到越来越广泛的重视。抗药基因可通过基因水平转移等方式在不同环境介质间传播并使其产生耐药性［1］。整合子作为一种与耐药基因水平传播有关的可移动基因元件，通过基因盒的位点特异重组系统捕获和转移抗药基因，同时提供启动子实现基因盒的表达。作为携带多种耐药基因的重组表达系统，整合子在广泛的环境介质中被检出，已成为当前抗性基因水平转移研究领域的另一热点［2－3］。目前公认的整合子有Ⅳ类，其中第Ⅰ、Ⅱ类整合子是在捕获和表达耐药基因中最常见的［4－5］。

养殖环境作为抗药因子的孳生地、储藏库和扩散源，已引起全球性的关注。水产养殖易发生细菌性病害，水和底泥环境中微生物群落多样性复杂，抗性基因宿主广泛，有些病原菌本身也是人类病原菌，这些人畜共患病原菌耐药性的获得及其病害的发生和流行将会给人类带来灾难性的后果。前期研究发现［6］，连云港赣榆县水产养殖区耐药菌多为致病性弧菌，且对多种抗生素耐药，因此继续深入认识和了解该地区耐药菌的产生机制以及抗生素传播途径意义重大，能够为有效控制抗药基因污染提供理论依据，对合理使用抗生素及控制耐药性的发生和扩散起着极其重要的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源 本研究前期成功从连云港赣榆县九里乡、海头镇和青口盐场3个水产养殖区筛选得到66株多抗性菌株［6］，将其作为检测抗药基因水平转移机制的目标菌种。

1.1.2 主要试剂和仪器 Taq DNA聚合酶（MBI，USA）；5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷（X－gal）（Sigma）；异丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）（Sigma），Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2.0（TaKaRa），pMD19－Tsimple Vector（TaKaRa），PTC－200TMPCR仪（BioRad），凝胶成像仪（BIORAD），电泳仪（BIORAD）。

1.2 样品DNA提取

耐药菌株采用水煮法快速提取基因组DNA。挑取适量菌苔于200μL双蒸水中，煮沸10min，0℃快速冷却5min，4℃10 000r／min离心5min，取上清液即可作为PCR扩增的待用模板。

养殖区底泥样品宏基因组DNA采用Fast PrepTMFP120（Thermo Electron Corp，USA）核酸提取仪进行破碎前处理，FastDNA○R SPIN Kit for Soil快速提取试剂盒进行提取。所有的DNA均取自0.3g左右的沉积物样品。提取的基因组DNA用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，λDNA／HindⅢ（天根生化科技（北京）有限公司）作为标准的分子量标记，－80℃保存。

1.3 整合子基因检测

依据文献［7］，通过引物IntI1－F／IntI1－R和In－tI2－F／IntI2－R对Ⅰ、Ⅱ类整合酶基因进行扩增，引物5’－CS／3’－CS对整合子可变区进行PCR扩增。PCR反应体系（终体积25μL）为100μmol／L dNTP，1.5μmol／L MgCl2，1×Taq buffer，2μmol／L primer，1.5UTaq DNA聚合酶，1μL DNA模板。无菌去离子水作为PCR反应的负对照。

整合子PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55／50℃退火30s，72℃延伸60s，运行30个循环；最后72℃延伸10min。

整合子可变区PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30s，58.5℃退火45s，72℃延伸2 min，运行30个循环；最后72℃延伸10min。

PCR产物通过琼脂糖凝胶进行电泳，紫外凝胶成像系统观察结果。D2000被用来作为标准分子量标记。

1.4 底泥16SrRNA克隆文库构建

细菌克隆文库构建采用F27和R1492为引物进行PCR，采用TaKaRa试剂盒进行纯化，纯化后PCR产物通过连接试剂盒连接到pMD19－Tsimple Vector，将连接好的载体转化入Top10大肠杆菌（TaKaRa）感受态细胞。在涂有X－gal和IPTG的氨苄青霉素的LB平板上进行蓝白斑筛选，随机挑取克隆子，采用特异引物RV－M和M13－47的PCR扩增进行插入片段的筛选。

1.5 测序及系统进化分析

选取PCR扩增片段大小正确的阳性克隆以及整合子基因扩增PCR产物，送上海生物工程技术服务有限公司进行序列测定。测序结果运用BLAST软件与GenBank数据库中已有序列进行核酸比对，确定克隆子菌属以及整合酶、基因盒类型。利用Dotur软件对全部克隆子进行97%cutoff水平下的操作单元（OTU）划分，选取已测核酸序列和最高相似度比对序列共同进行分析，运用MEGA version 4.1软件Neighbor－Joining方法构建系统发育树（如图1所示）。

2 结果与讨论

2.1 整合子检测结果

本项目对常见的Ⅰ类、Ⅱ类整合子进行检测，同时利用NCBI数据库已有数据，对携带的耐药基因盒进行序列分析。利用特定引物对整合酶进行检测，检测结果发现，Ⅱ类整合酶基因扩增结果全部为阴性。Ⅰ类整合酶基因PCR产物片段大小与预期相符，经测序和核酸序列同源性分析，与GenBank已知的Ⅰ类整合酶基因同源性为99%。在被检测的66株多抗性菌种中，有42株携带Ⅰ类整合酶基因。对整合酶阳性样品进行基因盒区域扩增，仅有两个样品被检测到含有基因盒结构，得到不同长度的片段，大小分别为1.08，0.79，0.49，0.23kb。根据克隆和测序结果可知，大小为0.23kb和0.49kb的短片段是空基因盒，没有携带任何抗药基因，1.08 kb和0.79kb的片段主要为携带编码氨基糖苷类耐药性的aadA1基因以及传递对甲氧苄啶类抗菌药的dfr17基因。

由此可见，连云港赣榆县3个养殖区采样站位整合子类型以Ⅰ型为主，细菌对甲氧苄啶类、氨基糖甙类抗菌药的耐药性与基因盒的存在有直接关联，但是其他类型的抗生素耐药，如氨苄青霉素、土霉素、红霉素，并没有证据显示与整合子捕获基因盒有直接关系。整合子—基因盒系统已经成为抗生素耐药水平传播的又一重要途径。

图1 16SrRNA基因克隆文库构建的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of bacterial 16SrRNA clone library

2.2 底泥微生物群落调查结果

利用细菌通用引物进行克隆文库构建，得到底泥中微生物群落组成。3个站位共得到克隆子210个，核酸序列97%cutoff获得OTU 98个（A33， B24，C41）。将测序16SrRNA序列在NCBI数据库中进行比对，分析结果发现序列与NCBI数据库中的序列具有高相似度（≥97%）。结合最相似比对序列，构建系统进化树。3个站位细菌微生物群落多样性丰富，其中弧菌属是优势菌群，同时也发现黄杆菌属、梭菌属、硫酸盐还原菌以及少量肠道致病菌。养殖区底泥微生物的多样性为抗性基因的传播提供了广泛的宿主，某些致病菌抗性的获得将会增加人类健康的风险。

3 结论

对从连云港赣榆县3个养殖场筛选得到的66株多抗性细菌进行整合子基因检测，发现Ⅰ型整合子占据优势，Ⅱ型整合子未检出。甲氧苄啶类、氨基糖甙类耐药基因的形成与基因盒捕获有关。整合子—基因盒系统已成为该调查区域重要的抗性基因传播途径。养殖区底泥微生物群落多样性丰富，为抗性基因的传播提供了广泛宿主。耐药基因传播机制的深入研究，对海水养殖区域合理使用抗生素以及耐药细菌污染预防提供了理论依据。

［1］ BARLOW R S，PEMBERTON J M，DESMARCHELIER P M，et al.Isolation and characterization of integron－containing bacteria without antibiotic selection［J］.Antimicrob Agents Chemother，2004，48（3）：838－842.

［2］ HALL R M，COLLIS C M.Mobile gene cassettes and integrons：capture and spread of genes by site－specific recombination［J］.Molecular Microbiology，1995，15（4）：593－600.

［3］ RECCHIA G D，HALL R M.Origins of the mobile gene cassettes found in integrons［J］.Trends of Microbiology，1997，5（10）：389－394.

［4］ PLOY M C，LAMBERT T，COUTY J P，et al.Integrons：an antibiotic resistance gene capture and expression system［J］.Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，2000，38（6）：483－487.

［5］ MAZEL D，DYCHINCO B，WEBB V A，et al.A distinctive class of integron in the Vibrio cholerae genome［J］.Science，1998，280（5363）：605－608.

［6］ 王春艳，阎斌伦.连云港市赣榆县水产养殖环境中哈氏弧菌耐药性研究［J］.淮海工学院学报：自然科学版，2013，22（1）：88－91.

［7］ WANG Chunyan，DANG Hongyue，DING Yongsheng.Incidence of diverse integrons andβ－lactamase genes in environmental Enterobacteriaceae isolates from Jiaozhou Bay，China［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2008，24：2889－2896.