张璐,张燕军,苏蕊,王瑞军,李金泉

内蒙古农业大学动物科学学院,动物遗传育种与繁殖自治区重点实验室,呼和浩特 010018

在基因组内除包含编码序列外,还存在着大量的非编码序列。随着研究的深入,人们逐渐认识到非编码序列同样具有重要的生物学功能,在参与基因的表达调控过程中扮演着重要角色。MicroRNA作为非编码RNA中的一员,其重要的调控功能越来越受到研究人员的关注。Yi等[1]研究发现,micro-RNA在皮肤中的表达模式同毛囊中的表达模式存在差异性; Andl等[2]进一步研究阐明,microRNA在毛囊周期性生长的不同时期的表达也存在差异性,microRNA是调控皮肤和毛囊生长发育过程中的重要因子。

1 MicroRNA的发现、形成及生物学功能

MicroRNA是一类长度约为 18～25nt的非编码小 RNA,通过剪切和抑制蛋白质翻译的方式负调控靶基因。MicroRNA最早在线虫(C.elegans)中发现,命名为 lin-4,其在细胞发育过程中起着重要的时空调控作用[3]。此后,microRNA作为基因表达调控的开关,相继在多个物种中被发现。MicroRNA在进化中高度保守,主要通过转录后调控在生物体内行使其重要功能。在哺乳动物中约 30%编码蛋白基因受microRNA的分子调控[4]。目前,已有大约25000种microRNA在 193种动物、植物以及微生物中被鉴定[5]。MicroRNA的形成首先由编码基因在细胞核内转录形成初级microRNA,然后被 Drosha酶复合体切割为具有茎环结构的 microRNA 前体(premicroRNA)[6],经输出蛋白 Exportin5从核内运输到胞质中[7],再经Dicer酶切割成microRNA双体,包含成熟的microRNA和互补链。成熟的microRNA 5′端的第2～8个核苷酸被称为microRNA的种子序列,是microRNA发挥作用的关键序列结构。MicroRNA在发挥调控作用时,成熟 microRNA会选择性的整合到RNA诱导沉默复合物中,作用于其靶基因的3′非翻译区内的调控位点[8]。MicroRNA的表达具有时空特异性,一个 microRNA能够调控多个基因的表达,几个 microRNA也可以共同调控某个基因的表达[9]。MicroRNA在疾病的发生、细胞分化、细胞发育、细胞凋亡、免疫反应、脂肪代谢、激素分泌等多种生理过程中[10～12],以及肺癌、肝癌、结肠癌、白血病和细菌感染等多种病理过程中[13～17]都发挥着重要的功能。

2 毛囊的结构特征和周期性生长发育

皮肤是覆盖在动物身体的表面最大的器官系统,分为表皮、真皮和皮下组织。表皮属于复层上皮,由角质层、透明层、颗粒层、棘层和基底层组成[18],主要包括角质化细胞和树突状细胞。真皮位于表皮下,由致密的结缔组织构成,分为乳头层和网状层,乳头层与表皮相连形成的圆锥状隆起为真皮乳头,对毛囊形态发生有重要作用。皮下组织位于真皮下,由松散的结缔组织构成,连接肌肉和骨膜。毛囊是一个形态和结构较为复杂的皮肤附属器官,它控制着毛发的生长,其最为显著的特性就是再生。毛囊由上皮和真皮两部分组成,包括连接组织鞘、内根鞘、外根鞘、毛球和毛干几部分[19]。毛囊可分为初级毛囊和次级毛囊,初级毛囊形成髓质发达的粗毛,而次级毛囊产生无髓毛。不同动物在毛囊密度和次级毛囊与初级毛囊比值(S/P)上存在很大差异[20]。毛囊的一个重要特征就是周期性生长,一般经历生长期、退行期和休止期3个阶段[21]。在毛囊生长期中,毛囊的皮脂腺和隆突部以上部位不发生凋亡和再生,此部位称为恒定部。毛囊隆突部以下部位呈现生长、退化和静止的周期变化,此部位称为循环部。毛囊生长期中,干细胞被激活,毛芽向下延伸与毛乳头相互作用,毛球上皮细胞和毛母质细胞不断分裂增殖,形成毛球、内根鞘和毛干。同时,外根鞘和组织鞘由外层细胞形成。随着毛囊的生长,毛囊达到真皮深部,它的附属结构皮脂腺、竖毛肌等也完全出现。退行期中,毛乳头细胞增殖减少,大量细胞凋亡,毛球上皮组织萎缩,毛乳头外露,毛囊整体变短,形成棒状毛。进入休止期,凋亡终止,真皮乳头处于休眠状态[22]。关于毛囊周期性发育机制,Stenn等[23]提出了 7种假说,包括表皮学说、毛乳头形态发生学说、隆突激活学说、共谐学说、震动信号学说、胚胎周期学说和抑制-去抑制学说。

3 皮肤毛囊生长发育相关microRNA的鉴定

随着高通量测序技术的完善,结合生物信息学的发展,后基因组时代为 microRNA的研究提供了更好的途径。近年来,越来越多的研究人员都利用高通量测序技术,鉴定和预测与皮肤毛囊发育相关的microRNA。Liu等[24]对藏绵羊(Ovis aries)生长期、退行期和休止期的皮肤毛囊组织进行测序,共发现成熟 microRNA 244个,其中 204个为保守microRNA,35个为新 microRNA,5个被收录在microRBase中; 进一步鉴定了3个时期6个差异表达 microRNA (oarmi R-103-3P、oar-miR-148b-3P、oar-miR-320-3P、oar-miR-31-5P、oar-novel-1-5P和oar -novel-2-3P),发现 microRNA可能通过调控MAPK和 Wnt等通路中的靶基因来调控毛囊生长。Yuan等[25]对陕北白绒山羊(Capra hircus)不同时期的皮肤毛囊进行测序,鉴定了 399个保守的microRNA,其中326个microRNA在生长期、退行期和休止期都有表达,分别有 3个、12个和 11个microRNA在3个时期特异性表达; 鉴定了172个候选的新microRNA,其中有36个在3个时期都有表达,分别有23个、29个和44个microRNA在3个时期特异性表达; 通过GO注释和KEGG基因富集,23.08%的microRNA靶基因涉及了278种生物功能,其中 5个主要的功能途径(代谢途径、致癌途径、MAPK信号通路、内吞作用和粘着斑)可能与毛囊的周期性生长有关。Liu等[26]以绒山羊(Capra hircus)生长期的皮肤毛囊为样品,通过测序鉴定了22个新的 microRNA与 316个保守 microRNA; 在保守microRNA中,68个microRNA已在microRBase中收录,其余248个microRNA在其他物种中比较保守,但在绒山羊中未见报道,推测可能对绒山羊皮肤和毛囊的发育具有重要作用。此外,研究表明山羊与绵羊共表达的 microRNA在染色体上的定位也相同[26]。Zhang 等[27]鉴定了鸭子(Anas platyrhynchus var.domestica)microRNA,预测了7个候选靶基因,该靶基因与毛囊形态发生相关的 Wnt/β-catenin、Shh/BMP和Notch通路有关; 发现了microRNA在羽毛毛囊和羽绒毛囊生长中调节机制有所不同,在羽毛毛囊和哺乳动物毛囊的生长中,涉及的microRNA及microRNA家族也不尽相同; 分析了与他物种间的保守 microRNA聚类结果,表明皮肤特征相似物种的 microRNA聚在同一组,进一步说明microRNA在皮肤毛囊进化过程中起着重要作用。

4 MicroRNA对皮肤毛囊发育的作用机制

Yi等[1]发现胎鼠中 miR-199家族在毛囊中高表达而在皮肤中无表达,而 miR-200家族都有表达[1],说明microRNA表达具有组织特异性。miR-203是一种依赖于 p63的分子开关,它通过抑制增殖能力和诱导细胞周期来调节基底层细胞的增殖和棘层细胞的最终分化[28,29],从而影响皮肤的发育。miR-203在体内存在许多靶基因(p63、Skp2和 Msi2 等),可以调控细胞更新、分化和DNA损伤应答[30]。miR-205是上皮与间质转化的调节因子,影响角化细胞迁移,引起细胞骨架的再造,使丝状肌动蛋白显著减少和焦点黏触增加[31],通过控制 PI3-K通路,调节新生儿皮肤干细胞的增殖[32]。miR-181a在雏鸡内耳毛细胞再生中发挥作用[33]。miR-17、miR-30、miR-15、miR-8和let-7在山羊、绵羊和小鼠皮肤中均有表达,与皮肤发育有关[34]。let-7b和miR-24的靶基因中有一些与毛囊生长发育和毛发品质相关[35]。Cheng等[36]研究发现,miR-29b和miR-29c的靶基因是Smads、catenin及 Ras,均为无痕愈合信号通路中的关键因子,推测其与皮肤伤口愈合有关[36]。miR-206-3p可能通过转录后调控 Bdnf,参与小鼠皮肤神经发育过程[37]。在角质细胞中,miR-184的表达抑制argonaute2蛋白表达,argonaute2是miRNA诱导沉默复合物的组成部分[38]。miR-429与调节皮肤色素沉着相关[39]。Zhu等[40]研究发现,miR-25与被毛的颜色相关,在皮肤及毛发生长发育过程中也起着调控作用。皮肤中的 microRNA还参与了皮肤对紫外线照射的应答[41]。

此外,在皮肤发育和毛囊周期性生长中,需要许多信号通路及调控因子共同作用。主要包括 Wnt信号通路、Notch信号、Shh信号通路和TGF-β因子等,部分 microRNA及其相关蛋白通过影响信号通路实现调控作用。

4.1 MicroRNA与Wnt信号通路

Wnt通路刺激毛囊干细胞分化,促进毛囊从休止期到生长期的转换。Mardaryev等[42]研究表明,miR-31能够负调控 Wnt和 BMP信号通路中Sclerostin和BAMBI元件、Fgf10因子、Dlx3转录因子和角蛋白的表达。miR-31在小鼠毛囊生长期显著上调,在退行期和休止期下调,推测miR-31在生长期初期抑制毛囊生长发育,在生长期的中期和晚期,促进毛母质细胞的分化和毛干的形成,在毛囊正常生长和毛纤维形成中起到维持表达平衡的作用。此外,miR-31还可以定向作用于一些角质化细胞的特异 mRNA,调控角化细胞骨架中必需成分角蛋白14、16和17的表达。Dickkopf相关蛋白1(DKK1)是 Wnt信号通路的重要拮抗物,对毛囊的发育起负调控作用,在过表达DKK1的转基因小鼠的表皮内,miR-200b和 miR-196a的表达量会显著减少,推断miR-200 b和miR-196a与毛囊的生长相关[43]。

4.2 MicroRNA与Notch和shh信号通路

Andl等[2]研究发现,在新生小鼠中Dicer缺失会使毛囊发育不良,增长缓慢。在Dicer突变体中,即使毛干和内根鞘已经开始分化,出生后的第7 d,shh和 Notch信号分子表达缺失,毛囊真皮乳头异常,无法形成正常毛干,毛囊缺少干细胞并退化。与毛囊增殖的减少相反,表皮出现增生过多。这一现象表明Dicer和microRNA在毛囊和皮肤发育过程中起着重要的作用。此外,miR-184能够干扰miR-205,可能具有抑制毛囊生长,促进衰退的作用[44]。唐晓惠[45]预测了 miR-184及 miR-205的靶基因及作用通路,发现其与shh、Wnt信号通路相关。

4.3 MicroRNA与TGF-β因子

转化生长因子β(TGF-β)超家族由分泌型多肽分子 TGF-β、活化素、抑制素和骨形成蛋白(BMPs)等组成,其中 TGF-β在促使毛囊由生长期过渡到退行期过程中起主要作用。BMP对毛囊生长起抑制作用,在休止期时对抗Wnt通路的激活作用。Liu等[46]研究表明,miR-18b通过调控靶基因 SMAD2抑制TGF-β1介导的人毛囊间充质干细胞向平滑肌细胞分化。Ducy等[47]研究表明,BMP2和BMP4基因均表达于毛干的前体细胞,同时,BMP4在真皮乳头中也表达; BMP7表达于内根鞘、外根鞘和真皮乳头。当小鼠缺少BMP2抑制因子Noggin时,毛囊明显减少,证实 BMP2可能抑制毛囊的形态发生[48]。为了研究 microRNA是否对 BMP信号输出有影响,Ahmed等[49]研究发现,不同BMP4处理水平的小鼠角质细胞中的 microRNA表达量不同,BMP4对miR-21的表达有显著的抑制作用。用 miR-21转染角质细胞,发现了 2类 BMP靶基因,分别是依赖BMP的肿瘤抑制基因和依赖miR-21的Id1、Id2、Id3和 Msx2。前者受 miR-21的负调控,后者负责调控BMP在细胞分化中的作用。

5 结语与展望

microRNA在皮肤毛囊中的作用机制表明,microRNA的调控作用是一个复杂的生理网络,microRNA分子之间不仅存在协同和拮抗作用,而且在行使功能时也需要相关的酶和蛋白协助。目前,对于皮肤毛囊发育中 microRNA作用机制的研究只是凤毛麟角,仍有大量的信息亟待被挖掘。随着新一代高通量测序技术的普及利用,皮肤毛囊相关的microRNA的研究报道越来越多,但目前这些报道多停留在对 microRNA的筛选、鉴定及其靶基因预测上,对其在皮肤毛囊发育中的调控机制、不同动物 microRNA表达的特异性、调控皮肤毛囊的特异microRNA及毛囊不同生长周期差异表达的microRNA等方面的研究仍然非常欠缺。特异microRNA的鉴定和调控机制的阐明对于皮肤疾病及毛发生长具有重要的意义,不仅有助于疾病的治疗,同时为绒毛生长的分子调控机理提供理论指导。绒山羊作为我国特色遗传资源,其绒毛具有较高经济价值,是重要的出口创汇产品。通过高通量技术手段并结合生物信息学,研究 microRNA在绒山羊毛囊生长发育调控作用,必然为筛选与绒毛生长及品质相关的基因及分子育种提供理论基础。

[1]Yi R,O'Carroll D,Pasolli HA,Zhang ZH,Dietrich FS,Tarakhovsky A,Fuchs E. Morphogenesis in skin is governed by discrete sets of differentially expressed micro-RNAs. Nat Genet,2006,38(3): 356–362.

[2]Andl T,Murchison EP,Liu F,Zhang Y,Yunta-Gonzalez M,Tobias JW,Andl CD,Seykora JT,Hannon GJ,Millar SE.The miRNA-processing enzyme dicer is essential for the morphogenesis and maintenance of hair follicles. Curr Biol,2006,16(10): 1041–1049.

[3]Lee RC,Feinbaum RL,Ambros V,The C. elegansheterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell,1993,75(5): 843–854.

[4]Lewisbp,Shih IH,Jones-Rhoades MW,Bartel DP,Burge CB. Prediction of mammalian microRNA targets. Cell,2003,115(7): 787–798.

[5]Alvarez-Garcia I,Miska EA. MicroRNA functions in animal development and human disease. Development,2005,132(21): 4653–4662.

[6]Lee Y,Ahn C,Han J,Choi H,Kim J,Yim J,Lee J,Provost P,Rådmark O,Kim S,Kim VN. The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing. Nature,2003,425(9): 415–419.

[7]Lund E,Guttinger S,Calado A,Dahlberg JE,Kutay U.Nuclear export of microRNA precursors. Science,2004,303(5654): 95–98.

[8]Viswanathan SR,Dsley GQ. Lin28: A microrna regulator with a macro role. Cell,2010,140(4): 445–449.

[9]蔡婷,刘志红,王志新,赵濛,俎红丽,李金泉. miRNA在调控皮肤和毛囊发育中的作用. 遗传,2013,35(9):1087–1094.

[10]Naguibneva I,Ameyar-Zazoua M,Polesskaya A,Ait-Si-Ali S,Groisman R,Souidi M,Cuvellier S,Harel-Bellan A. The microRNA miR-181 targets the homeobox protein Hox-A11 during mammalian myoblast differentiation. Nat Cell Biol,2006,8(3): 278–284.

[11]Jakymiw A,Lian SL,Eystathioy T,Li SQ,Satoh M,Hamel JC,Fritzler MJ,Chan KL. Disruption of GW bodies impairs mammalian RNA interference. Nat Cell Biol,2005,7(12): 1267–1274.

[12]Naguibneva I,Ameyar-Zazoua M,Nonne N,Polesskaya A,Ait-Si-Ali S,Groisman R,Souidi M,Pritchard LL,Harel-Bellan A. An LNA-based loss-of-function assay for micro-RNAs. Biomed Pharmacother,2006,60(9):633–638.

[13]Eder M,Scherr M. MicroRNA and lung cancer. N Engl J Med,2005,352(23): 2446–2448.

[14]Varnholt H. The role of microRNAs in primary liver cancer. Ann Hepatol,2008,7(2): 104–113.

[15]Nakajima G,Hayashi K,Xi Y,Kudo K,Uchida K,Takasaki K,Yamamoto M,Ju J. Non-coding MicroRNAs hsa-let-7g and hsa-miR-181b are associated with chemoresponse to S-1 in Colon Cancer. Cancer Genomics Proteomics,2006,3(5): 317–324.

[16]Eiring AM,Harb JG,Neviani P,Garton C,Oaks JJ,Spizzo R,Liu SJ,Schwind S,Santhanam R,Hickey CJ,Becker H,Chandler JC,Andino R,Cortes J,Hokland P,Huettner CS,Bhatia R,Roy DC,Liebhaber SA,Caligiuri MA,Marcucci G,Garzon R,Croce CM,Calin GA,Perrotti D. miR-328 functions as an RNA decoy to modulate hnRNP E2 regulation of mRNA translation in leukemic blasts. Cell,2010,140(5): 652–665.

[17]Wang S,Zhang Z. Maggot microRNA: A new inhibitory pathway to bacterial infection. Med Hypotheses,2011,76(2): 254–255.

[18]席海燕. 绒山羊皮肤干细胞定位、迁移及次级毛囊生长期差异表达基因文库的构建与筛选[学位论文]. 呼和浩特: 内蒙古农业大学,2009.

[19]Alonso L,Fuchs E. The hair cycle. J Cell Sci,2006,119(3): 391–293.

[20]杨剑波,甘尚权,杨永林,张红琳,宋天增,冯静,杨井泉,高磊,石国庆,沈敏. 绵羊 ILK 基因的克隆及其在毛囊生长期的表达. 遗传,2012,34(6): 179–125

[21]李金泉,尹俊,周欢敏. 绒山羊绒毛生长调控机理研究进展. 中国草食动物,2001,3(3): 41–44.

[22]Schneider MR,Schmidt-Ullrich R,Paus R. The hair follicle as a dynamic miniorgan. Curr Biol,2009,19(3): R132–R142.

[23]Stenn KS,Paus RP. Controls of hair follicle cycling. Physiol Rev,2001,81(1): 449–494.

[24]Liu G,Liu R,Li Q,Tang X,Yu M,Li XY,Cao JH,Zhao SH.Identification of microRNAs in wool follicles during Anagen,Catagen,and Telogen Phases in Tibetan Sheep. PLoS ONE,2013,8(10): e77801.

[25]Yuan C,Wang X,Geng R,He X,Qu L,Chen Y. Discovery of cashmere goat (Capra hircus) microRNAs in skin and hair follicles by Solexa sequencing. BMC Genomics,2013,14(7):511.

[26]Liu ZH,Xiao HM,Li HP,Zhao YH,Lai SY,Yu XL,Cai T,Du CG,Zhang WG,Li GQ. Identification of conserved and novel microRNAs in cashmere goat skin by deep sequencing.PloS ONE,2012,7(12): e50001.

[27]Zhang L,Nie QH,Su Y,Xie XJ,Luo W,Jia XZ,Zhang XQ.MicroRNA profile analysis on duck feather follicle and skin with high-throughput sequencing technology. Gene,2013,519(1): 77–81.

[28]Yi R,Poy MN,Stoffel M,Fuchs E. A skin microRNA promotes differentiation by repressing 'stemness'. Nature,2008,452(7184): 225–229.

[29]Wei TL,Orfanidis K,Xu N,Janson P,Ståhle M,Pivarcsi A,Sonkoly E. The expression of microRNA-203 during human skin morphogenesis. Exp Dermatol,2010,19(9): 854–856.

[30]Jackson SJ,Zhang Z,Feng D,Flagg M,O'Loughlin E,Wang D,Stokes N,Fuchs E,Yi R. Rapid and widespread suppression of self-renewal by microRNA-203 during epidermal differentiation. Development,2013,140(9): 1882–1891.

[31]Yu J,Peng H,Ruan Q,Fatima A,Getsios S,Lavker RM. MicroRNA-205 promotes keratinocyte migration via the lipid phosphatase SHIP2. FASEB J,2010,24(10): 3950–3959.

[32]Wang DM,Zhang ZJ,Loughlin EO,Wang L,Fan XY,Lai EC,Yi R. MicroRNA-205controls neonatal expansion of skin stem cells by modulating the PI(3)K pathway. Nat Cell Biol,2013,15(10): 1153–1163.

[33]Corey S,Frucht,Santos-Sacchi J,Navaratnam DS. MicroRNA181a play a key role in hair cell regeneration in avian auditory epithelium. Neurosci Lett,2011,493(1–2):44–48.

[34]刘丹丹,赫晓燕,郝欢庆. MicroRNAs在动物皮肤和毛发发育中的调控作用. 中国生物化学与分子生物学报. 2010,26(9): 802–808.

[35]赫晓燕,郝欢庆,刘丹丹,范瑞文,曹靖,朱芷葳,董彦君,邢海权. 青年羊驼耳部和背部皮肤组织中 miRNA差异表达研究. 中国生物化学与分子生物学报,2010,26(11):1016–1022.

[36]Cheng J,Yu H,Deng S,Shen GF. MicroRNA profiling in mid-and late-gestational fetal skin: implication for scarless wound healing. Tohoku J Exp Med,2010,221(3): 203–209.

[37]穆原,周红,李文艳,李耀武. miR-206–3p在小鼠皮肤中的表达及其作用. 临床检验杂志,2013,31(7): 523–534.

[38]Roberts JC,Warren RB,Griffiths CE,Ross K. Expression of microRNA-184 in keratinocytes represses argonaute. J Cell Physiol,2013,228(12): 2314–2323.

[39]Yan B,Liu B,Zhu CD,Li KL,Yue LJ,Zhao JL,Gong XL,Wang CH. microRNA regulation of skin pigmentation in fish.J Cell Sci,2013,126(Pt15): 3401–3408.

[40]Zhu Z,He J,Jia X,Jiang J,Bai R,Yu X,Lv L,Fan R,He X,Geng J,You R,Dong Y,Qiao D,Lee KB,Smitha GW,Dong C. MicroRNA-25 functions inregulation of pigmentation by targeting the transcription factor MITF in alpaca (Lama pacos)skin melanocytes. Domest Anim Endocrin,2010,38(3):200–209.

[41]Syed DN,Khan MI,Shabbir M,Mukhtar H. MicroRNAs in skin response to UV radiation. Curr Drug Targets,2013,14(10): 1128–1134.

[42]Mardaryev AN,Ahmed MI,Vlahov NV,Fessing MY,Gill JH,Sharov AA,Botchkareva NV. Micro-RNA-31 controls hair cycle-associated changes ingene expression programs of the skin and hair follicle. FASEB J,2010,24(10):3869–3881.

[43]Ryan DG,Olivera-Fernandes M,Lavker RM. MicroRNAs of the mammalian eye display distinct and overlapping tissue specific. Mol Vis,2006,12(10): 1175–1184.

[44]Yu J,Ryan DG,Getsios S,Oliveira-Fernandes M,Fatima A,Lavker RM. MicroRNA-184 antagonizes microRNA-205 to maintain SHIP2 levels in epithelia. Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(49): 19300–19305.

[45]唐晓惠. 藏绵羊毛囊不同发育时期miRNAs表达变化研究[学位论文]. 武汉: 华中农业大学,2012.

[46]Liu X,Song L,Liu J,Wang S,Tan X,Bai XG,Bai TT,Wang YM,Li MY,Song YL,Li YL. miR-18b inhibits TGF-β1-induced differentiation of hair follicle stem cells into smooth muscle cells by targeting SMAD2. Biochem Biophys Res Commun,2013,438(3): 551–556.

[47]Ducy P,Karsenty G. The family of bonemorphogenetic proteins. Kidney Int,2000,57: 2207– 2214.

[48]Chen D,Zhao M and Mundy GR. Bone morphogenetic proteins. Growth Factors,2004,22(4): 233–241.

[49]Ahmed MI,Mardaryev AN,Lewis CJ,Sharov AA,Botchkareva NV. MicroRNA-21 is an important downstream component of BMP signalling in epidermal keratinocytes.J Cell Sci,2011,124(Pt 20): 3399–3404.